《表1 耐四环素基因引物序列》

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《紫外线辐照对四环素耐药细菌及基因的消毒特性》

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利用SYBR GreenⅡ定量PCR，选取两种典型的四环素耐药基因（tetA、tetO）进行定量检测。这两种基因代表了细菌对四环素具有耐受性的两种重要机制，tetA可以编码四环素外排泵蛋白，而tetO可以编码核糖体保护蛋白[12]。四环素耐药基因引物的建立和优化参照文献[1]进行。引物序列及相关信息见表1。将耐药基因导入质粒当中进行无性增殖从而获得含目的基因的质粒，对其进行转化、提取后通过紫外分光光度计检测其浓度。进行4～5个梯度稀释，以初始浓度的对数为横坐标、CT值为纵坐标绘制标准曲线（R2均大于0.99）。用SYBR GreenⅡPremix（天根）试剂进行实时定量PCR反应（ABI7500）。PCR反应体系（体积为20μL），包括染料试剂10μL，目的基因上、下游引物各0.3μL，待测DNA模板1μL，无菌水8.4μL。反应程序:先在94℃下预变性3 min，再在94℃下变性10 s，然后根据表1退火温度退火30 s，最后在72℃下充分延伸32s，共进行40个循环。每个样品平行测定3次以确保准确性，每组基因PCR回收效率在88%～110%之间。