《表1 褐色橘蚜RR-2型CPR家族基因定量和ds RNA合成相关引物信息》

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《褐色橘蚜RR-2型表皮蛋白基因鉴定及功能分析》

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下划线部分为T7启动子序列。The underlined letters represent T7 promoter sequence.

从1.2.1鉴定到的CPR家族基因中随机选择褐色橘蚜Tc CPR7和Tc CPR68基因，并根据其c DNA序列，利用Primer Premier 5.0软件设计ds RNA合成引物（表1），并对其在褐色橘蚜生长发育中的潜在功能进行评价。引物由北京擎科生物科技有限公司合成。利用1.2.2获得的褐色橘蚜N1～N4龄期若虫及不同翅型成蚜混合的c DNA为模板，以不含T7启动子的引物进行PCR扩增。25μL反应体系：Ex Taq 0.25μL、10×Ex Taq Buffer 2.5μL、Mg Cl22.5μL、2.5 mmol/L d NTP Mixture 2.0μL、c DNA 1.0μL、dd H2O 15.0μL、10μmol/L上下游引物各1.0μL。PCR反应程序：95℃预变性30 s；95℃变性5 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35个循环；最后72℃再延伸10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，利用Wizard?SV Gel and PCR Clean-Up System和p MD 19-T Easy Vector分别对目的条带进行回收纯化和连接转化，经蓝白斑筛选后取阳性克隆子送至上海英骏生物技术有限公司进行测序。序列确认无误后，将菌液进行扩大培养，并利用EZNA Plas‐mid Mini Kit I进行质粒抽提，以质粒提取产物为模板，利用含T7启动子序列引物进行PCR扩增，反应体系和条件同上，仅将循环数设置为41，并再次回收PCR扩赠产物。以该PCR产物为模板，利用Transcript Aid T7 High Yield Transcription Kit合成高质量ds RNA，备用。