《表1 酶切位点修改引物序列》

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《环状定点诱变技术在载体构建中的应用》

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方框表示拟突变的Bam HI酶切位点

信号肽后前6个氨基酸决定信号肽酶切割效率，对周质空间分泌表达至关重要[13]。为了优化药物候选分子7NB2AA周质空间表达，对信号肽后酶切位点进行改造。原始载体p UC57-7NB2AA的Pel B信号肽后为Nco I酶切位点，编码MG两个冗余氨基酸残基，+1蛋氨酸侧链较大，不利于周质空间表达。利用环状定点诱变技术对其进行改造，删除Nco I酶切位点和修改为Bam HI小侧链氨基酸（GS）。使用表1引物，p UC57-7NB2AA质粒为模板扩增目的序列，Dpn I消化去除原始质粒，转化DH5α，提取质粒，酶切鉴定、测序。结果显示，挑选克隆均为阳性，测序序列与预期一致，环状定点诱变技术高效可行（图4、图5，封四）。酶切位点修改在载体改造和表达量优化中使用频繁。本研究通过环状定点诱变技术可以高效、快速实现酶切位点删除和替换。