《表2 酶切位点引物序列》

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《芒果MinSPS1基因的克隆及表达载体的构建》

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注:下划线:酶切位点Note:Underline:The cleavage site

测序结果比对正确之后，设计含有酶切位点引物（表2）。PCR反应体系:1μL c DNA模板，上下游引物（10 pmol/μL）各0.5μL、10μL TaKaRa PrimeSTAR MaxDNA聚合酶和8μL ddH2O；PCR反应程序:98℃预变性5 s；98℃10 s，57℃15 s，72℃1 min，35个循环；72℃延伸10 min；利用KpnⅠ和XbaⅠ限制性内切酶对p CAMBIA1301空载体进行双酶切，双酶切反应体系:限制性内切酶各1μL、2μg空载体、5μL 10×Buffer，用ddH2O补加至50μL，然后37℃反应30 min。利用无缝克隆的方法将带有同源臂的目的片段与线性化载体进行同源重组，反应体系为:2μL In fusion同源重组酶、100～200 ng线性化载体、目的片段按照与线性化载体的摩尔比为1∶2适量添加，最后用ddH2O补加至10μL，然后50℃反应20 min，并迅速转至冰上。转化到Trans-T1大肠杆菌感受态细胞中，挑取阳性菌液扩繁提质粒进行双酶切检测，最后转化GV3101农杆菌感受态，筛选阳性菌液，将菌液与50%的甘油按照体积1∶1混合，于-80℃保存。