《表1 实验中使用的引物序列》

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《香鱼白细胞介素-1受体相关激酶3(IRAK-3)的序列特征及对鳗弧菌感染的免疫相关性分析》

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Pa IRAK-3-PF和Pa IRAK-3-PR：斜体部分分别为Eco RⅠ和XhoⅠ的酶切位点，下划线处为保护碱基

从Illumina Hi Seq 2000测序的香鱼单核/巨噬细胞转录组序列中分析获得Pa IRAK-3基因的c D‐NA序列，根据该序列设计特异性引物Pa IRAK-3-PF/Pa IRAK-3-PR（表1)，PCR方法克隆Pa IRAK-3并测序，反应体系与条件如下。PCR反应体系共25μL，组分如下：10×LA buffer 2.5μL、Pa IRAK-3-PF/Pa IRAK-3-PR （10μmol/L）各1μL、d NTP （2.5μmol/L）3.5μL、dd H2O 16.25μL、LA Taq DNA聚合酶0.25μL、香鱼脾脏c DNA模板0.5μL。使用Mastercycler pro梯度PCR仪(eppendorf，德国）进行PCR，反应条件为：94℃预变性2 min；94℃30 s，58℃30 s，72℃60 s，30个循环；72℃延伸10 min。利用1%琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行分析，阳性克隆送英潍捷基贸易有限公司（上海）测序，鉴定准确后进行序列分析。通过Compute p I/Mw程序（http://web.expasy.org/compute＿pi/）预测Pa IRAK-3的蛋白分子量大小及等电点；使用BLASTP软件（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）对IRAK-3同源蛋白序列进行比对分析；利用Clustal W软件（http://clustalw.ddbj.nig.ac.jp/）进行IRAK-3同源蛋白的多重序列比对分析；通过MEGA 5.0软件（Mat‐thijnssens et al.，2008）基于邻接法（neighbor-joining，NJ）构建IRAK-3的系统进化树。