《表1 用于c DNA-AFLP分析的引物》

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《利用cDNA-AFLP技术分析‘窄冠黑白杨’杂种优势的差异表达基因》

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c DNA-AFLP分析参照Bachem等（1998）的方法，对c DNA双链进行酶切、预扩增和选择性扩增，使用Eco RI（NEB，USA)和Mse I （NEB，USA）两对限制性内切酶进行酶切。首先使用预扩增引物进行扩增，为选择性扩增提供模板，在预扩增引物的基础上增加2个碱基作为选择性扩增引物，以提高扩增的特异性。引物由上海生工公司合成（表1）。预扩增反应体系为25μL，其中10×Ex Taq PCR Buffer2.5μL，25 mmol·L-1 Mg Cl2 2.5μL，2.5 mmol·L-1d NTP 2μL，连接产物2.5μL，10μmol·L-1引物各1.5μL，5 U·μL-1 Taq酶0.125μL，dd H2O定容至25μL。预扩增反应程序:94oC预变性5 min；94oC变性30 s，56oC退火1min，72oC延伸1 min，30个循环；72oC延伸7min，反应后4oC保存。选择性扩增反应体系:预扩增样品经过TE稀释至1 ng·μL-1后取3μL，10×PCR buffer 2.5μL，1 U·μL-1 Taq 0.2μL，2.5mmol·L-1 d NTPs 1.5μL，10μmol·L-1 Mse I引物、Eco RI引物各1.5μL，dd H2O补充到25μL。PCR反应程序:94oC预变性5 min；94oC变性30 s，65oC退火(每个循环降低0.7oC）1 min，72oC延伸1 min，13个循环；94oC变性30 s，56oC退火30 s，72oC延伸1 min，22个循环；72oC延伸7 min，反应后4oC进行保存。通过6%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，染色显影后，记录c DNA-AFLP图谱上所有适宜引物组合的条带情况，将清晰条带处标记为“1”，无条带显示处记为“0”，进行统计。