《表1 用于qPCR分析的基因引物列表》

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《"雄激素1,4-雄烯二酮和雄烯二酮对斑马鱼胚胎昼夜节律和下丘脑-垂体-性腺轴通路中基因转录表达的影响"》

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注：a引自Shi等[28]；b引自Shi等[30]；c引自Liang等[33]；d引自Liang等[34]。

根据笔者课题组前期已经建立好的方法[31-32]进行RNA提取、c DNA合成和实时荧光定量PCR分析。具体如下：利用Trizol方法提取胚胎中的RNA；使用Smart SpecTMPlus Spectrophotometer（Bio Rad，USA）检测RNA质量和浓度；所有RNA样品的260 nm和280 nm比值在1.8～2.0。使用东洋纺试剂盒（ReverTra Ace?qPCR RT Master Mix with g D-NA Remover，Japan）将RNA逆转录为c DNA。目标基因引物均参考笔者课题组已发表的论文[28，30，33-34]。引物设计和要求如下：使用batchprimer3设计跨越内含子的引物并利用Primer-BLAST（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/）分析引物的特异性，再交由上海生工合成；引物的扩增效率均在95%～105%之间。在Applied BiosystemsTMQuantS-tudioTM7 Flex平台上进行荧光定量PCR分析。反应体系如下：总体积为20μL，包括10μL THUN-DERBIRD SYBR?q PCR Mix试剂（Toyobo），0.4μL上游引物，0.4μL下游引物，2.5μL c DNA样品和6.7μL DEPC水。反应条件为：预变性后，在95℃×15 s、60℃×60 s进行40个循环。引物信息如表1中所示。Shi等[28]的研究已表明，斑马鱼长期暴露于去氢孕酮（dydrogesterone，DDG）后，RpL13α、Actin-β和EF1-α这3个内参基因表达均非常稳定。Liang等[29]的研究也表明，斑马鱼胚胎分别暴露于炔雌醇（17α-ethinylestradiol，EE2）、甲炔诺酮（norgestrel，NGT）和EE2+NGT中96 h后，上述3个内参基因转录表达都非常稳定。因此，qPCR的结果利用RpL13α、Actin-β和EF1-α这3个内参基因转录表达水平的平均值对目标基因进行归一化分析。然后，采用-ΔΔCT方法分析目标基因相对于内参基因的差异表达倍数[35]。