《表1 试验中用到引物：米曲霉3.042尿苷/尿嘧啶营养缺陷型遗传转化体系的构建》

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《米曲霉3.042尿苷/尿嘧啶营养缺陷型遗传转化体系的构建》

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注：下划线的部分为酶切位点。

pk5质粒的构建：以p44为出发质粒，米曲霉3.042基因组为模板扩增所需片段。根据NCBI上已经公布的米曲霉RIB40乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶基因（pyr G）序列（AO090011000868）设计上下游引物，以米曲霉3.042基因组为模板扩增pyr G基因并送至华大测序。pyr G基因包括834 bp的CDS区和65 bp内含子。首先以F0和R0引物扩增pyr G基因片段并送至华大基因测序。以1-F和1-R引物，2-F和2-R引物分别扩增得到pyr G左侧上游同源臂pyr GL和pyr G右侧下游同源臂pyr GR。用1-F和1-R引物将两同源臂片段融合成一个片段pyr GLR。将p44质粒和片段pyr GLR用Eco RI和HindⅢ双酶切，连接获得质粒pk5，并化转至大肠杆菌。以大肠杆菌菌液为模板验证pk5质粒敲除框全长。pk5质粒用于同源重组敲除米曲霉pyr G基因。本研究所用引物均由金唯智生物科技公司合成，如表1所示。