《表1 研究中用到的引物序列》

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《小麦TaGAPDH5基因的亚细胞定位和表达分析》

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注:下划线部分的核苷酸分别形成Nco I酶切位点.

以本人前期克隆并测序正确的含有目的基因全长的pMD19-T+TaGAPDH5质粒DNA为模板，根据ClonExpress誖II One Step Cloning Kit（VAZYME）说明书要求，设计分别带有酶切位点Nco I（CCATGG）的基因序列扩增特异性引物（表1）（下游引物无终止密码子） ，进行PCR扩增:94℃预变性4 min，94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，循环数32，72℃延伸10 min.PCR产物电泳检测后，切胶回收，同时使用特异性限制性内切酶QuickCt TM Nco I对表达载体pCaMV35S:GFP进行酶切，电泳检测后切胶回收，检测浓度.将回收的目的片段和线性化载体按照说明书进行重组反应，构建亚细胞定位融合表达载体，转入大肠杆菌DH5α中.挑取单克隆过夜培养后，菌液PCR验证，提取阳性克隆菌液的质粒，酶切验证后测序.将测序结果正确的重组质粒使用基因枪（PDS-1000，Bio-Rad，美国）法瞬时转化至洋葱表皮细胞，pCaMV35S:GFP载体作为阳性对照同时进行转化.基因枪转化洋葱表皮细胞试验具体方法参照文献[19-21].利用转盘式激光共聚焦显微镜（Olympus，日本）观察原生质体中GFP的表达情况.