《表3 不同IPTG处理条件下bace16敲低菌株的蛋白酶及杀线虫活性》

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《利用CRISPR/dCas9系统构建适用于芽胞杆菌基因敲减的重组质粒及其应用》

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为了探究p BD1系统在芽胞杆菌中的基因敲低功能，采用杀线虫芽胞杆菌B16菌株的bace16作为靶标基因。d Cas9用于大肠杆菌基因表达调控的研究显示，只有靶向基因非模板链的sg RNA才能有效抑制基因表达，而且sg RNA靶向位置越靠近转录起始位点则抑制效率越高（Qi et al.，2013）。本研究将3条靶向不同位置的sg RNA1～3装入重组质粒p BD1，分别电转入杀线虫芽胞杆菌B16，产生3种表达不同sg RNA的基因敲低突变株。实时荧光定量PCR结果显示，表达sg RNA2和sg RNA3的菌株中，bace16基因的表达量与野生株相比没有明显变化；而表达靶向非模板链启动子区sg RNA1的敲低突变株中，bace16基因表达量相比对照菌株明显下降（图4）。脱脂牛奶平板上的结果显示（图5），sg RNA1表达菌株的bace16蛋白酶活性也发生显著变化，在没有IPTG诱导的情况下，表达sg RNA1的敲低菌株和对照菌株（转化p BD1空质粒）的透明圈直径（约为6.0 cm）没有显著差别；在IPTG诱导下，bace16蛋白酶水平所下降，当IPTG浓度为1.0mmol/L时，透明圈几乎丧失，与对照比较差异显著（表3）。上述结果提示，表达sg RNA1能有效抑制bace16表达，且该抑制能实现可逆回复。