《表1 cp4 epsps基因分段表达引物设计》

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《CP4-EPSPS蛋白抗原表位鉴定及其快速DAS-ELISA检测方法的建立》

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EcoRⅠ酶切位点：GAATTC；XhoⅠ酶切位：CTCGAG

根据Gen Bank上cp4 epsps基因序列（AY125353），利用合成多肽法将其分段表达为部分氨基酸重叠的4条多肽：CP4-EPSPS1～304、CP4-EP‐SPS152～456、CP4-EPSPS152～253、CP4-EPSPS203～304，设计含Eco RⅠ和XhoⅠ酶切位点的特异性引物（表1），以p ET-28b-CP4质粒为模板进行PCR扩增（50μL体系），质粒模板0.5μL，Taq酶1.0μL，buffer 5.0μL，10μmol/L上下游引物各1μL，d NTP 4.0μL，水37.5μL。反应条件是94℃预变性3 min；94℃变性20 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，30个循环；72℃反应5 min；反应终止。用Eco RⅠ和XhoⅠ对p GEX-6p-1载体进行双酶切，同时对目的基因PCR扩增产物和酶切载体大片段进行胶回收，通过InFusion试剂盒连接目的片段和载体，构建重组质粒并转化大肠杆菌Rosetta感受态细胞，分别表达CP4-EPSPS1～304、CP4-EPSPS152～456、CP4-EPSPS152～253和CP4-EPSPS203～3044条多肽。通过间接ELISA分析鉴定5株MAb所识别CP4-EPSPS蛋白的抗原表位：4℃过夜包被表达的4条多肽5μg/m L；加入5%脱脂奶250μL/孔，37℃封闭1 h；将5株单抗1∶5000稀释，100μL/孔，37℃孵育1 h；将HRP标记的兔抗小鼠Ig G 1∶10 000稀释，100μL/孔，37℃孵育1 h，以上操作每步结束后，PBST洗3遍；TMB显色液100μL/孔，避光显色15 min，2 mol/L H2SO450μL/孔，终止反应，测定OD450值。根据公式：检测样品OD450（P值）/阴性对照OD450（N值）≥2.1判定检测结果为阳性。