《表1 引物设计：杉木涩籽形成过程的花青素还原酶基因表达》

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《杉木涩籽形成过程的花青素还原酶基因表达》

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根据本实验室杉木转录组测序得到的ANR基因的部分序列，在其高度保守的区域进行特异性引物设计，正反向引物分别是ANR-F和ANR-R。以c DNA原液为模板进行RT-PCR扩增，PCR反应条件为94℃预变性2 min；94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，反应35个循环；72℃延伸10 min，4℃保存。1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，紫外切胶仪回收扩增条带，胶回收试剂盒进行纯化后连接PCR产物到p MD-18T载体，随后转入DH5α大肠杆菌，菌液PCR筛选阳性克隆后送至华大基因公司测序。基于测序的保守片段，设计特异引物扩增ANR基因的5'和3'端序列，以上试验参照了SMARTerRACE 5'/3'Kit试剂盒说明书。利用巢式PCR进行ANR 5'RACE和3'RACE实验，PCR产物回收测序，将克隆到的5'、3'端和保守区序列用DNAMAN软件进行拼接，获得ANR基因的全长c DNA序列。利用ORFfinder工具确定ANR基因的ORF区域，再根据全长c DNA序列设计扩增ORF序列的特异性引物，PCR反应后回收产物，再次测序验证ORF序列是否准确。以上实验所用到的引物如表1所示。