《表1 RIPK3-siRNA合成序列》

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《RIPK3在磨损颗粒激活巨噬细胞PRRs/NLRP3信号通路引起人工关节无菌性松动中的作用机制》

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在PubMed上查询目的基因RIPK3的基因编号及相关基因序列.将该序列交由上海吉玛公司设计合成small interfering RNA （siRNA）.合成序列如表1所示.配置转染体系:400μL无血清Opti-MEM培养基，24 pmol siRNA，4μL的RNAiMAX.充分混匀后孵育15 min.2 h后将转染体系加入六孔板中（400μL/孔），效率检测后选取敲低效率最高的RIPK3-1128及RIPK3-493序列进行构建重组慢病毒.将上述序列合成包装成有short hairpin RNA（shRNA）和green fluorescent protein（GFP）的慢病毒（滴度:8×108TU/mL）.六孔板每孔种植4×105个巨噬细胞，24 h后使用无血清Opti-MEM培养基换液培养.构建慢病毒转染体系:200μL慢病毒+4μg polybrene混匀后孵育10 min.2 h后将转染体系加入六孔板中（200μL/孔），消化细胞，离心洗涤后送流式细胞分选.利用流式细胞分选挑选GFP阳性的巨噬细胞，获得稳转株.定期观察检测巨噬细胞的GFP荧光情况.定期复测转染效率.