《表1 合成的EPCR siRNA序列》

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《稳定敲低人脐带间充质干细胞EPCR基因对其向成纤维细胞分化能力的影响》

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根据GenBank中人EPCR基因（NM＿006404）信息，采用干扰序列设计软件设计3条siRNA的靶序列（表1），分别将这3个siRNAs用LipfectmaineTM2000导入hUC-MSCs，以未导入siRNAs的细胞为对照，转染浓度为50 nmol/L，hUC-MSCs于转染前1 d接种于6孔板中，每孔细胞数约为1×105，每孔加入不含抗生素的完全培养基（20%FBS的DMEM/F12）。转染前，用不含血清培养基Opti-MEM R I分别稀释siRNA和Lipfectmaine TM2000后，轻轻混匀，室温孵育20 min。将siRNA-Lip2000混合液加入6孔板中的hUC-MSCs，正常条件（37℃和5%CO2）培养6 h后，将孔中含siRNA-Lip2000混合液培养基移去，更换为不含抗生素完全培养基，继续正常条件培养48 h后收细胞沉淀提取蛋白，用Western blot检测3个siRNAs和对照组对hUC-MSCs内EPCR表达抑制程度。RIPA细胞裂解法提取总蛋白，BCA法定量蛋白质。30 mg蛋白质上样，8%SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白，250 mA电流条件下转膜60 min，用含5%牛血清白蛋白（BSA）的TBST室温封闭1 h，一抗（EPCR 1∶1 000，GAPDH:1∶20 000)4℃孵育过夜，洗膜3次后，二抗（1∶5 000）室温孵育1 h后再洗膜3次，ECL发光液显色。将得到的条带用Gel-Pro analyzer分析软件分析，得到EPCR和GAPDH的灰度值，EPCR的灰度值比上GAPDH的灰度值即为EPCR蛋白的相对表达量。