《表1.扩增抑菌物质合成关键基因的引物序列》

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《桑树内生拮抗菌的分离鉴定及其对桑断枝烂叶病的生防初探》

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将新鲜的拮抗菌接种至Landy培养基，置于恒温摇床25°C、200 r/min培养3 d获得拮抗菌株活性发酵液。采用酸沉淀法[34]提取活性发酵液中脂肽类化合物。具体方法为：新鲜的拮抗菌株发酵液于4°C、8000 r/min离心20 min，用浓HCl将上清液pH调至2.0，4°C静置沉淀12 h，4°C、8000 r/min离心20 min后，加适量甲醇充分溶解沉淀，静置3 h后于4°C、8000 r/min离心10 min，用直径为0.22μm的微孔滤膜过滤，取滤液于60°C烘箱中使甲醇充分挥发，再进行样品冻干处理，得到活性发酵液脂肽类化合物的粗提物，最后进行高效液相色谱串联质谱仪（LC-MS）分析。LC-MS分析使用Agilent 1290 Infinity Ultra Performance Liquid Chromatography与Agilent 6545 UHD and Accurate-Mass Q-TOF质谱联用仪，其中色谱柱型号为Waters XSelect?HSS T3（2.5μm，100 mm×2.1 mm）。流动相为A–水溶液（含0.1%甲酸）和B–乙腈（含0.1%甲酸）；柱温设为25°C，进样量为4μL，流速设为0.35 mL/min。优化的色谱梯度：0–2 min，5%B；2–10 min，5%–95%B；10–15 min，95%B；15–18 min，5%B。质谱使用正离子模式结合负离子模式；干燥气体流量：10 L/min；干燥气体温度：325°C；雾化器压力：20 psig；碰撞电压：120 V；skimmer voltage，45 V。质谱的采集范围50–1500 m/z，在质谱采集中打入参比离子监测质量轴的准确性。进一步鉴别拮抗菌株代谢物采用MS/MS，collision energy使用10、20、40 V三个能量。数据系统分析运用Agilent Masshunter Qualitative Analysis B.07.00 software。