《表1 荧光定量引物设计 (内参为Actin)》

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《氮素形态和水平对茶树生理特性的影响》

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从NCBI上获得目标基因GS和GOGAT序列，登录号分别是EF055882和JN602371，应用Primer Premier 5.0软件设计引物，在上海生工生物进行合成。拿到引物后，首先进行普通PCR验证，再根据Real-time PCR仪器上检测引物PCR产物的样品溶解曲线进一步验证PCR扩增的特异性。使用Tiangen Biotech公司的RNA提取试剂盒并且按试剂盒说明书提取样品RNA。使用核酸测定仪测定样品RNA的浓度，再根据OD260/OD280和OD260/OD230值，确定样品纯度；同时进行琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像系统进行成像，检测RNA完整性。确定RNA合格后，使用Ta Ka Ra公司的反转录试剂盒把RNA模板反转录成c DNA模板，产物稀释到适合Real-time PCR的浓度，进行荧光定量PCR。以Action作为内参基因[33]，所用荧光引物见表1。反应体系为:SYBR®；Premix Ex Taq™；II（Tli RNase H Plus）12.5μL，引物F、R各1μL，c DNA模板2μL，dd H2O补充至20μL；反应程序为:95°C热启动30 s；94°C 5 s，60°C 30 s，循环数39个。基因相对表达量分析按照2-ΔΔCT（Livak）法[35]。