《表1 小鼠IL-6基因启动子扩增引物信息》

  提示：宽带有限、当前游客访问压缩模式

本系列图表出处文件名：随高清版一同展现

《转录因子KLF7对IL-6基因的转录调控分析》

1. 获取 高清版本忘记账户？点击这里登录

1. 下载图表忘记账户？点击这里登录

注：斜体表示15 bp桥接碱基，下划线部分为酶切位点，上游引物（F1～F4）包含内切酶SmaⅠ位点，下游引物（R1）包含内切酶XhoⅠ位点。

采用Primer Premier 5.0软件设计5条IL-6基因启动子扩增引物，其中4条为上游引物（F1、F2、F3、F4）和1条下游引物R1。根据Clon Express II One Step Cloning Kit试剂盒要求，各片段上游（F）和下游（R）引物5'端和3'端分别引入SmaⅠ和XhoⅠ酶切位点和15 bp桥接碱基序列（见表1中斜体部分序列），以小鼠鼠尾和耳朵基因组DNA为模板，按照诺唯赞Phanta Max Super-fidelity DNA Polymerase说明书，具体PCR反应体系为50μL:1μL Phanta Max Super-fidelity DNA Polymerase，25μL 2×Phanta Max Buffer，1μL d NTP Mix，5μL基因组DNA模板，上下游引物各2μL，14μL dd H2O补足体系。PCR反应条件：95℃预变性3 min；经95℃15 s，退火60℃15 s，72℃延伸2 min，共35个循环；72℃彻底延伸5 min，4℃保存。PCR扩增出IL-6基因4个不同长度启动子片段。采用1.2%琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，利用DNA凝胶回收试剂盒纯化PCR产物，送金唯智公司测序。测序正确的IL-6基因4个启动子片段，采用Clon Express II One Step Cloning Kit试剂盒，反应体系为20μL:4μL启动子片段，4μL线性化p GL3-basic载体，4μL 5×CEⅡBuffer，2μL ExnaseⅡ，6μL dd H2O补足体系。37℃反应30min，与双萤光素酶报告基因载体p GL3-basic连接、转化到大肠杆菌感受态细胞。重组体经菌落PCR鉴定和测序确认无误后，将得到IL-6基因4个5'端截短的启动子报告基因载体，分别命名为p GL3-IL-6(-1776/+70）、p GL3-IL-6(-483/+70）、p GL3-IL-6(-220/+70）和p GL3-IL-6(-143/+70）。