《表2 SREBP1基因启动子扩增引物》

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《基于双荧光素酶报告基因系统的人源SREBP1基因启动子的活性研究》

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小写字母碱基为引物的互补重叠序列

培养HepG2细胞，按照试剂盒说明书抽提HepG2细胞基因组。以基因组DNA为模板，PCR扩增SREBP1基因启动子，扩增片断约2 000 bp（引物序列见表2）。50μL PCR反应体系:10×PCR Buffer for KOD-Plus-Neo 5μL、2 mmol/L d NTPs 5μL、25mmol/L MgSO43μL、上下游引物（10μmol/L）各1.5μL、KOD-Plus-Neo 1μL、基因组DNA模板5μL、ddH2O 28μL。PCR反应条件:94℃预变性2 min；98℃变性10 s，63℃退火30 s，68℃延伸1 min，35个循环；68℃延伸10 min。PCR产物电泳检测，用DNA凝胶回收试剂盒纯化回收后，-20℃保存。用KpnⅠ、XhoⅠ双酶切质粒pGL3-Basic，50μL酶切反应体系:10×Buffer 5μL、质粒5μg、KpnⅠ0.5μL、XhoⅠ0.5μL、ddH2O补足至50μL。37℃酶切1.5 h后终止反应，酶切产物用DNA凝胶试剂盒纯化回收后，-20℃保存。Gibson Assembly是一种基于双链DNA分子同源序进行无缝拼接的DNA连接方式。其中克隆的DNA片段与预处理好的pGL3-Basic载体两末端具有相互重叠的核酸序列，以保证DNA片段按正确的顺序进行拼接，再将这些片段直接加入混合酶（T5核酸外切酶、DNA合成酶、DNA连接酶）中，一步完成无缝拼接，流程图见图1。连接体系为10μL:载体2μL，克隆片段2μL，Gibson Assembly Mix 6μL，50℃反应1 h。连接产物经转化Trans1-T1感受态细胞，挑阳性菌落接种于20 mL氨苄抗性的LB培养基中，37℃、250 r/min振荡培养过夜后，提取质粒进行酶切鉴定，测序正确后命名为pGL3-SREBP1-pro。