《表1 鸡Srebp1基因的扩增引物》

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《鸡Srebp1基因的克隆及其功能片段在大肠杆菌中的表达》

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根据GeneBank数据库里的鸡Srebp1基因（NM＿204126）的cDNA序列，利用基因内的Kpn I和Not I酶切位点设计3对引物（序列见表1），由生工生物工程（上海）有限公司合成．取21日龄的鸡胚肝组织细胞，Trizol法提取总RNA，Prime ScriptTM RT reagent Kit扩增获得cDNA．采用LA Taq酶的高GC扩增体系，分别以gSREBP1-HF/gSREBP1-K-R1、gSREBP1-K-F1/gSREBP1-2090-R、g SREBP1-2090-F/gSREBP1-R1从cDNA中扩增得到Srebp1-700q、Srebp1-1 300z和Srebp1-1 500h 3个片段，反应体系：25μL 2×GC buffer I，8μL dNTP混合液（每种三磷酸核苷酸浓度分别为2.5 mmol/L)，10 mmol/L的Forward/Reverse引物各3μL，cDNA产物2μL，LA Taq酶2.5 U，ddH2O补足至50μL．反应条件：96℃5 min；96℃30 s，60℃30 s，72℃时间t（t=扩增片段长度Ln/1 000×60 s），进行35个循环；72℃10 min．将获得的3个片段分别克隆入pMD 19T质粒中，测序鉴定．取正确的片段，以Not I和Xho I、Kpn I和Not I、Hind III和Kpn I分别将Srebp1-1 500h、Srebp1-1 300z和Srebp1-700q依次插入pcDNA3.1(+）质粒中，获得含有全长鸡Srebp1基因编码区的pcDNA3.1（+）-g Srebp1重组表达质粒．