《表1 本试验所选用的Hasp8引物序列》

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《小麦条锈菌细胞质效应子Hasp8抑制植物基础免疫》

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在本课题组前期筛选获得的Hasp8基因序列的基础上，采集小麦条锈菌CYR31夏孢子和CYR31侵染小麦水源11后48 h和120 h的叶片，使用RNA试剂盒提取夏孢子和条锈菌侵染叶片的RNA，以2μg总RNA为模板利用反转录试剂盒合成cDNA。利用Primer 5设计Hasp8 ORF引物pCAMBIA1302-Hasp8-F/R、pCAMBIA1302-Hasp8△sp-F/R（去信号肽）、pGR106-Hasp8-F/R、pGR106-Hasp8△sp-F/R（去信号肽）、pEDV6-Hasp8-F/R（表1），以夏孢子与条锈菌侵染叶片的cDNA按浓度1∶1混合后作为模板，对Hasp8进行PCR扩增，引物均由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成。20μL PCR反应体系：2×Taq Master Mix 10μL、cDNA模板2μL、正反向引物各0.5μL，加ddH2O补足20μL。扩增程序：95℃预变性3 min；95℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，共40个循环；72℃延伸10 min。扩增结束后，对目的条带进行回收纯化，依照使用说明将纯化后的目的条带连接到p MD18 T-simple Vector，连接产物转化到大肠杆菌JM109菌株，转化菌株在LB培养基上培养，经蓝白斑筛选后，以M13-F、M13-R为检测引物（表1），挑选阳性克隆送北京奥科鼎盛生物科技有限公司测序。将测序后Hasp8基因编码的氨基酸序列在SignalP4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）在线网站上预测信号肽；在TMHMM 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM）预测跨膜结构域；利用NLStradamus(www.moseslab.csb.utoronto.ca/NLStradamus/）进行核定位信号的分析。