《表1 乳蛋白合成相关基因的引物》

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《赖氨酸对奶牛乳腺上皮细胞内乳蛋白合成相关基因表达和蛋白磷酸化的影响》

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BM ECs内总RNA按照Trizol法提取。将细胞以5×105个/孔的密度接种于6孔培养板，按试验设计培养结束后，用酶标仪检测总RNA的纯度与浓度，OD260 nm/OD280 nm在1.8~2.2表示提取的RNA纯度较好。总RNA完整性用2%琼脂糖凝胶电泳检测。将总RNA反转录成c DNA，采用Prime Script RT M aster M ix试剂盒的方法进行，反转录体系为10μL。基因表达量采用SYBR Premix Ex TaqT MⅡ试剂盒的方法进行测定，反应体系为20μL。以磷酸甘油醛脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，G APDH）为管家基因，对乳蛋白合成相关基因[α-酪蛋白（αs1-casein，CSN1S1）、β-酪蛋白（β-casein，CSN2）、κ-酪蛋白（κ-casein，CSN3）、酪氨酸激酶2（Janus kinase2，JAK 2）、信号转导和转录激活因子5（signal transducer and activator of transcription 5，STAT5）、m TOR、S6K1、4EBP1、e IF4E和A MPKα1]的表达量进行测定，其引物序列见表1。实时荧光定量PCR的反应程序为:95.0℃预变性30 s；95.0℃变性5 s，60℃退火34 s，72℃延伸20 s，进行40个循环反应；95℃、5 s，60℃、30 s，95℃、15 s，51个循环，绘制熔解曲线。基因的表达量采用2-△△Ct法计算。