《表1 PCR引物序列：白藜芦醇调控Hedgehog信号通路抑制肝星状细胞活化的研究》

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《白藜芦醇调控Hedgehog信号通路抑制肝星状细胞活化的研究》

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（1）提取总RNA：取6孔板培养的各组细胞，向每孔加入0.5 m L Trizol溶液，充分吹打。加入200μL氯仿剧烈振荡15 s，冰上静置10 min。于4℃以12 000 r/min离心20 min，吸取上层液体，转移到新的EP管中。加入等体积异丙醇，混匀，冰上静置10 min，于4℃以12 000r/min离心20 min。弃上清，沉淀体积分数75%乙醇洗涤2遍。常温下以7 500 r/min离心5 min，弃上清，沉淀干燥然后用20μL DEPC水溶解得到RNA原液，测各样本RNA浓度。（2）两步法实时逆转录PCR反应：(1）第1步逆转录：在无核酸酶的离心管中每个样本加入总RNA 4μg，5×PrimeScript RT Master Mix 2μL，RNase free H2O补足至10μL。反应条件：25℃10 min，42℃30 min，85℃10 min。cDNA将得到的样品-20℃短期保存。（2）第2步PCR反应：各引物见表1。SyberGreen预混Taq酶10μL，加上下游引物至总浓度10μmol/L，加入第1步得到的cDNA模板5μL（稀释10倍后），以DEPC-dd H2O补足至20μL，混匀，实时上机检测。反应条件为95℃3 min预变性，95℃10 s变性，60℃30 s退火，同时收集荧光，40个循环。由软件自动生成扩增曲线和熔解曲线判断其扩增效率，根据目标基因与GAPDH扩增产物的2-△△CT比值来分析计算各目标基因相对表达量。