《表1 用于桑树DFR和ANS基因克隆与表达分析的引物》

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《桑树二氢黄酮醇-4-还原酶和花青素合酶基因在桑椹中的表达谱及其与花青素含量的关系》

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在NCBI网站（http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/）查找已经登录的DFR和ANS基因，根据各物种基因的保守区（包含CDS区）序列用Oligo 7软件设计引物DFR-F1、DFR-R1、ANS-F1和ANS-R1（表1），以cDNA为模板进行PCR扩增。反应体系50μL:ddH2O 36.5μL，10×PCR Buffer（Mg2+plus）5μL，2.5 mmol/L dNTP mixture 4μL，rTaq0.5μL，目的基因上、下游引物（20μmol/L）各1μL，cDNA 2μL。扩增程序：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸40 s，共扩增35个循环；最后72℃延伸7 min。将得到的PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，用胶回收试剂盒（上海生工生物工程技术服务有限公司）回收目的条带，产物与pMD19-T Simple Vector(TaKaRa公司）载体相连接，转化TOP10感受态细胞，对筛选到的阳性克隆菌液进行测序分析。