《表1 本试验所用引物信息》

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《利用TRV-HIGS技术鉴定核盘菌致病相关的分泌蛋白基因》

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序列中斜体及下划线处字母代表相应的酶切位点The italicized and underlined letters represent the cleavage sites in the sequence

从核盘菌基因组数据库（http://www.broadinstitute.org/annotation/genome/sclerotinia＿sclerotiorum/MultiDo wnloads.html）中下载8个核盘菌候选基因的编码序列，用Primer Premier 5设计特异引物，并加入相应的酶切位点（引物信息见表1）。以核盘菌野生型菌株1980不同生长阶段的混合c DNA为模板，用基因特异引物进行PCR扩增，将扩增片段胶回收后连接到p GEMT-Easy载体，转化至大肠杆菌DH5α。挑选阳性单克隆送Invitrogen公司测序，培养测序正确的克隆（菌株）提取质粒。用限制性内切酶组合Eco RI/Sac I分别对阳性克隆质粒和p TRV2进行双酶切，将目的片段与骨架进行连接，转化大肠杆菌后进行菌落PCR，选取阳性克隆扩大培养并提取pTRV2-Gene载体的质粒。将重组质粒转化至农杆菌GV3101，挑选阳性单克隆的菌液加入50%的甘油1﹕1等体积混合于2 mL离心管中，保存于-80℃。利用相同方法成功构建了对照重组质粒p TRV2-GFP。