《表2 本研究所用的引物[28]》

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《甲羟戊酸途径限速步骤研究及其在产番茄红素重组大肠杆菌中的应用》

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采用CRISPR-Cas9系统辅助整合idi基因[31]。首先构建质粒pLacZ-N20-trc-idi，以pLacZ-N20质粒为模板，用lacZ-B-BsaI-F2/lacZ-B-BsaI-R2为引物，PCR扩增骨架，以pSC103-idi质粒为模板，用Ptrc-BsaI-AGCT-F/BS-idi-BsaI-R为引物，扩增trc-idi条带，两片段以等摩尔混合进行Golden Gate连接，并加入DpnⅠ酶消化模板，然后将连接产物化转商品感受态Trans-T1，涂于含有34μg/mL cam的LB平板，37℃培养过夜。用P15A-yz-up/99A-CPEC-R验证得到2 kb条带即为正确。在LYC104菌株中转化pRed＿Cas9和pLacZ-N20-trc-idi质粒，阿拉伯糖来诱导cas9表达，切割染色体上LacZ的N20区域；pLacZ-N20-trc-idi提供上下同源臂、trc启动子和idi基因进行染色体整合。整合后用99A-F/LacZ-yz-down引物进行验证，测序正确菌株命名为LYC105。验证引物见表2。