《表2 本研究中所用的主要引物》

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《柚皮素合成关键基因表达水平对目标产物积累水平的量化影响》

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为了使代谢途径基因协同表达，首先确定代谢途径关键基因过量表达对产物柚皮素含量的影响。选择6个不同强度的启动子（PGAL1、PTEF、PGAL7、PGAL10、PGAL2、PPGI1）分别表达4cl、chs、chi基因，并选取了基因组上LEU2和核糖体DNA（rDNA）作为整合位点。启动子PGAL1、PTEF、PGAL7、PGAL10通过实验室原有质粒为模板扩增获得，PGAL2、PPGI1和基因整合的上下游同源臂（上下游同源臂各500–1 000 bp）以S.cerevisiae S288C基因组为模板扩增得到，以HIS5作为营养缺陷标签。先将上下游同源臂、HIS5标签盒通过同源重组连接在T载上，在实验室已有质粒pY26-PGAL10-chs-PGAL1-4cl-PGAL7-chi、pY26-PGAL10-chi-PGAL1-chsPGAL7-4cl、pY26-PGAL10-chs-PGAL1-chi-PGAL7-4cl上分别扩增PGAL1-4cl-TGAL1、PGAL1-chs-TGAL1和PGAL1-chi-TGAL1片段，通过同源重组的方法得到质粒T-LEU2up-PGAL1-4cl-TGAL1-HIS5-LEU2down、T-LEU2upPGAL1-chs-TGAL1-HIS5-LEU2down、T-LEU2up-PGAL1-chi-TGAL1-HIS5-LEU2down、T-25Sup-PGAL1-4cl-TGAL1-HIS5-5Sdown、T-25Sup-PGAL1-chs-TGAL1-HIS5-5Sdown、T-25Sup-PGAL1-chi-TGAL1-HIS5-5Sdown，然后分别将另外5个启动子与这6个质粒中启动子PGAL1通过同源重组的方法替换，得到另外30个质粒。再通过引物Pf＿LEU2和Pr＿LEU2分别扩增3个基因在LEU2位点上的整合片段，引物Pf＿25S和Pr＿5S分别扩增3个基因在rDNA区域的整合片段。文中所用主要引物见表2。