《表2 qRT-PCR鉴定所需基因引物及片段大小》

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《鸡Wnt5a基因慢病毒干扰载体的构建及其稳定表达的胚胎干细胞系筛选》

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PLC：磷酯酶C；USP54：泛素特异性肽酶54；Oct4：八聚体结合转录因子4；Sox2：性别决定区Y框蛋白2；β-catenin：β-链蛋白；β-catenin:Beta catenin；下同

将DF1细胞用普通培养基于37℃、5%CO2恒温培养箱中进行培养，待24孔板中细胞密度生长到70%～80%时，将构建成功的重组载体按质粒（M）∶FuGENE HD（V）=1∶3的比例进行转染，以一孔为例：取1μg质粒，加入Opti-MEM补足到50μL作为A液；取3μL FuGENE HD，加入Opti-MEM补足到50μL作为B液。然后，轻轻吹打混合A液和B液，在37℃条件下孵育10～15 min。在细胞培养孔内加入100μL混合液和400μL普通培养基混匀，24 h后进行观察拍照，然后用嘌呤霉素筛选48 h后收集阳性细胞，提取其RNA。采用qRT-PCR筛选出最佳干扰序列，进行大量慢病毒包装。慢病毒包裹及滴度检测均由上海吉满生物科技有限公司完成。同时，利用qRT-PCR检测Wnt5a干扰载体对Wnt5b，Wnt3a和Wnt11等其他Wnt家族基因表达的影响（表2）。