《表2 引物序列及产物片段大小》

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《基于TCGA数据库分析、筛选并验证前列腺癌诊断或预后标志物》

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根据DNA提取试剂盒步骤提取总DNA，Nanodrop微量分光光度计检测总DNA浓度及纯度，取吸光度（A260/280nm）在1.8～2.0的总DNA样本，置-80℃保存。取500 pg～2μg DNA样本用EZ DNA MethylationGold试剂盒进行亚硫酸氢盐修饰。使用Meth Primer软件（http://www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi）针对不同基因启动子区（转录起始位点上游2 000 bp）设计甲基化特异性PCR引物。每个基因分别设计甲基化引物（gene-M）与非甲基化引物（gene-U），由华大公司合成。引物见表2。PCR产物长度均为150～250 bp，当基因启动子PCR区域甲基化程度增高时，使用甲基化引物PCR能够得到特异性条带，而使用非甲基化引物无法得到条带；而当基因启动子PCR区域甲基化程度减少时，结果与上述相反。甲基化特异性PCR反应体系50μL，包括亚硫酸氢盐处理的DNA 100 ng，Ta Ka Ra Taq DNA聚合酶（5 U/μL)1μL，10×PCR缓冲液5μL，d NTP（2.5 nmol/L）4μL，上/下游引物（10μmol/L）各2μL，dd H2O补足体积。甲基化特异性PCR循环参数：95℃3 min；94℃30 s、61℃20 s、72℃20 s，共37个循环；72℃5 min。PCR产物经20 g/L的琼脂糖凝胶电泳分析。