《表1 qRT-PCR所用引物序列》

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《慢性铅胁迫对日本沼虾硫氧还蛋白和热应激蛋白系统基因表达及肠道菌群的影响》

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用qRT-PCR对胁迫后各组虾肝胰腺中Trx（登录号KY465768）、硫氧还蛋白还原酶（thioredoxin reductase，TrxR）（登录号KY465769）、热应激蛋白60（heat shock protein 60，HSP60）（登录号KF028596）、热应激同源蛋白70（heat shock cognate protein 70，HSC70）（登录号DQ660140）和热应激蛋白90（heat shock protein 90，HSP90）（登录号GU319963）基因mRNA表达进行定量分析，以β-肌动蛋白（β-actin）（登录号FL589653）作为qRT-PCR反应中的内参基因，所有基因的扩增效率都大于97%。所用基因的引物序列见表1。qRT-PCR反应体积为20μL，包括10μL 2×SYBR Green Premix Ex Taq、引物（10μmmol/L）各0.2μL、2μL cDNA和7.6μL ddH2O。qRT-PCR反应条件为:95℃预变性10 min；94℃变性15 s、58℃退火20 s、72℃延伸20 s，共40个循环。PCR反应后绘制熔解曲线以判断扩增产物的正确性，温度以0.5℃/5 s的速度从60℃上升到95℃，所有基因的扩增效率基本相同，使用2-ΔΔCt方法[26]对基因mRNA相对表达量进行分析。