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第一章蛋白质分析的一些方法学问题1

一、天然蛋白质的研究1

目 录1

1．天然蛋白质的电泳2

2．区带电泳法4

1）纸电泳6

2）淀粉凝胶电泳6

3）琼脂凝胶电泳7

4）醋酸纤维膜电泳8

5）丙烯酰胺凝胶电泳8

1）术语9

3．通过免疫化学方法研究天然蛋白质9

2）沉淀反应概况10

3）免疫扩散法11

4）免疫扩散法的应用13

4．蛋白质的离子交换层析15

5．蛋白质的凝胶过滤分级分离18

参考文献22

综合文献23

二、顺序分析的方法学问题24

参考文献37

2．监视和检验实验精确度的方法41

综合文献41

1．电泳技术42

第二章蛋白质低压电泳分析法42

一、低压纸电泳42

2．染色方法50

1）蛋白质的染色法50

2）脂蛋白的染色法52

3）糖蛋白的染色法54

3．蛋白质低压纸电泳结果的测定57

1）用洗脱法进行定量测定57

2）用光电比色法进行定量测定59

4．低压纸电泳方法中一些误差的来源62

5．蛋白质的测定方法63

二、醋酸纤维薄膜电泳68

三、琼脂凝胶电泳71

1．垂直淀粉凝胶电泳74

四、淀粉凝胶电泳74

2．水平淀粉凝胶电泳76

五、丙烯酰胺凝胶电泳81

1．丙烯酰胺凝胶区带电泳81

2．盘状电泳（Disc electrophoresis）84

参考文献91

综合文献92

第三章中压及高压电泳方法93

一、水平中压电泳仪及其应用94

二、对角线电泳法103

1．对角线电泳制备胱氨酸肽103

2．对角线电泳制备甲硫氨酸肽105

3．对角线电泳制备组氨酸肽107

4．对角线电泳分离赖氨酸肽108

5．从蛋白质的胰酶解产物中分离胰酶解的C－末端肽段110

三、高压电泳技术110

参考文献112

综合文献112

第四章免疫化学的测定方法113

一、免疫血清的产生113

1．不加佐剂的免疫方法113

2．加用佐剂的免疫方法115

二、用沉淀反应分析蛋白质116

1．定性沉淀试验116

2．用稀释方法测定抗体的滴度118

3．抗原－抗体等价区的测定119

4．界面（环状）沉淀试验120

5．定量沉淀试验121

三、用凝胶扩散方法分析蛋白质123

1．简便、线性凝胶扩散法123

2．线性单向凝胶扩散法（又称试管双向扩散法）125

3．平面双向凝胶扩散法（又称平板双向凝胶扩散法）126

4．免疫电泳133

1）Grabar和William的常量免疫电泳法133

2）Scheidegger的微量免疫电泳法136

5．Ossermann的蛋白质比较分析法145

6．吸附免疫电泳147

7．免疫凝胶过滤148

8．电协同扩散对流免疫电泳149

9．用含抗体的琼脂糖凝胶电泳作蛋白质的定性和定量分析150

10．定量凝胶扩散法152

1）Feinberg的抗体梯度方法152

2）用含有特异性抗体的琼脂平板作蛋白质定量测154

定154

3）Backhausz的定量免疫电泳法155

11．醋酸纤维膜的蛋白质免疫扩散分析156

1）平面双向扩散156

2）免疫电泳156

参考文献157

综合文献158

2．蛋白质和肽的还原及羧甲基化159

第五章蛋白质和肽的水解159

1．蛋白质和肽的过甲酸氧化159

一、水解物质的准备159

二、蛋白质和肽的6N HCl水解160

三、蛋白质和肽的部分酸水解161

四、蛋白质和肽的胰蛋白酶水解161

五、蛋白质和肽的糜蛋白酶水解163

六、蛋白质和肽的胃蛋白酶水解163

七、蛋白质和肽的木瓜蛋白酶水解164

八、蛋白质的溴化氰裂解164

综合文献166

第六章用氨基酸自动分析仪定量测定氨基酸167

参考文献179

第七章氨基酸与肽的纸层析180

综合文献187

一、强酸性肽在Amberlite IR-4B柱上的分级分离188

第八章肽的离子交换层析188

二、碱性肽的Amberlite IRC-50柱层析189

三、肽在Dowex 50×2柱上用不挥发缓冲液分级分离190

四、肽在Dowex 50×2柱上用挥发性缓冲液分级分离192

五、肽的CM纤维素柱层析193

六、肽的DEAE纤维素柱层析195

综合文献197

第九章蛋白质的层析198

一、蛋白质的DEAE纤维素柱层析198

1．OH－型DEAE纤维素柱198

2．Cl－型DEAE纤维素柱200

3．在脲存在下的DEAE纤维素层析201

综合文献202

4．血清蛋白的DEAE纤维素柱层析203

二、蛋白质的阳离子交换纤维素柱层析206

1．CM纤维素206

2．血清蛋白在磷酸纤维素（phospho-cellulose）柱上的分级分离208

3．血清蛋白在CM纤维素柱上的分级分离209

三、血清蛋白在DEAE葡聚糖凝胶柱上的分级分离210

四、在DEAE葡聚糖凝胶上通过“分批”技术制备γ球蛋白213

综合文献214

第十章蛋白质和肽的凝胶过滤215

一、蛋白质溶液在葡聚糖凝胶柱上的脱盐215

二、用葡聚糖凝胶浓缩蛋白质溶液216

三、血清蛋白通过凝胶过滤进行分级分离216

四、γG球蛋白的大分子量片段在葡聚糖凝胶柱上的分离218

8．ε-DNP-Lys的制备219

五、酶解产物在葡聚糖凝胶G-50柱上的预分级分离221

六、通过循环凝胶过滤分离蛋白质223

综合文献225

第十一章薄层层析226

一、氨基酸及其衍生物的薄层层析229

1．DNP－氨基酸230

2．PTH－氨基酸231

3．Dansyl－氨基酸231

4．肽232

二、薄层凝胶过滤233

参考文献236

综合文献237

第十二章蛋白质与肽的末端分析和逐步降解238

一、N－末端2,4－二硝基氟苯测定法238

1．蛋白质二硝基苯化239

2．DNP－蛋白质或肽的水解与DNP－衍生物的提取240

3．DNP－氨基酸的纸层析241

4．以薄层层析鉴定DNP－氨基酸245

5．DNP－氨基酸的间接鉴定245

6．DNP－衍生物的定量测定247

7．DNP－氨基酸的制备248

二、N－末端氨基酸丹磺酰化测定法249

1．丹磺酰化技术（Hartley,1970）250

2．DNS－氨基酸的鉴定251

1）纸上电泳鉴定DNS－氨基酸251

2）薄层电泳鉴定DNS－氨基酸253

3）聚酰胺薄层层析鉴定DNS－氨基酸255

3．DNS－氨基酸的制备257

三、以异硫氰酸苯酯降解法测定N－末端顺序258

四、蛋白质的PTC降解260

五、肽的Dansyl-Edman顺序分析法261

六、肽的Edman降解与定量氨基酸分析顺序分析法262

1．PTH－衍生物的检测263

2．PTH－氨基酸制备263

七、用亮氨酸氨肽酶测定N－末端顺序264

八、肼解法测定C－末端267

九、羧肽酶消化法测定C－未端顺序269

参考文献271

综合文献271

第十三章氨基酸衍生物的气相色谱分析272

一、前言272

二、原理273

1．方法步骤274

1）进样274

2）分离275

3）检测、记录、计算、鉴定277

2．方法原理277

三、气相色谱分析氨基酸衍生物及肽的特殊仪器要求和实验条件279

1．工作温度279

2．进样器280

3．柱填料281

4．氨基酸分析用的气相色谱仪的要求283

5．气相色谱图的定量计算283

四、衍生物的分析性质284

1．氨基酸衍生物的制备284

2．保护功能团法制备衍生物292

3．氨基酸的化学转化法制备衍生物300

4．氨基酸降解法制备衍生物301

五、氨基酸的热解反应302

六、氨基酸衍生物的气相色谱法302

七、氨基酸定量分析问题308

八、肽的气相色谱法311

1．Biemann法312

2．Weygand法314

参考文献325

一、引言326

第十四章等电点聚焦326

二、基本原理327

三、两性载体328

1．必需具备的条件328

2．制备方法329

3．两性载体的性质329

1．以液体为介质330

四、等电点聚焦330

2．以凝胶为介质336

1）颗粒凝胶为介质336

2）聚丙烯酰胺凝胶为介质337

3．等电点聚焦后Ampholine的除去方法338

参考文献340

一、序言341

二、原理341

第十五章荧光技术341

三、试剂342

1．荧光胺的制备及其特性342

2．对装置及其它化学试剂的要求343

四、应用范围344

五、荧光技术在柱层析及非柱层析法中的应用345

1．非柱层析345

2．柱层析347

六、应用实例351

2．肽与糖肽的分子量测定351

1．肽的纯化351

3．用荧光氨基酸分析仪测定蛋白质或肽的氨基酸355

组成355

4．肽的氨基酸顺序测定357

5．肽的合成358

6．肽的定量分析359

7．生理研究360

参考文献361

第十六章蛋白质和肽顺序的质谱测定362

一、前言362

应用范围365

操作365

1．N－乙酰全甲基衍生物的制备365

二、寡肽顺序的质谱测定法365

原理365

2．质谱分析367

评注369

参考文献374

一、引言376

离中的应用376

第十七章高效液相色谱及其在氨基酸、肽和蛋白质分376

二、原理377

三、仪器装置380

1．高压输液泵380

2．梯度淋洗装置381

3．层析柱381

4．进样器382

5．检测器384

四、实验条件选择384

1．层析填料——固定相384

2．洗脱液——移动相386

1．PTH－氨基酸387

五、应用举例387

2．小肽分离388

3．小鼠垂体中β－内啡肽的分离390

参考文献392

第十八章蛋白质和多肽的放射免疫分析393

一、基本原理393

二、测定的主要条件和步骤395

三、抗原的制备和标记396

1．抗原的制备400

2．抗原的标记401

3．*Ag的分离纯化408

4．*Ag的质量鉴定和比放射性测定411

四、抗血清的制备419

1．抗血清的产生419

2．抗血清的质量鉴别421

五、*AgAb复合物的分离425

1．双抗体法425

2．中性盐和溶剂沉淀法427

3．非特异性吸附法427

4．免疫特异吸附法428

六、标准曲线及其制作过程431

1．标准曲线的制作过程431

2．标准曲线的其它作图方法432

七、生物样品测定434

八、灵敏度及提高灵敏度常用的手段435

2．提高抗血清的稀释倍数436

1．降低*Ag用量436

3．改变加样次序437

九、精确度及影响精确度的因素438

1．影响精确度的因素439

十、附录441

参考文献443

第十九章亲和层析446

一、载体要求447

二、载体简介447

1．多孔玻璃载体447

2．聚丙烯酰胺凝胶载体447

3．纤维素载体448

4．葡聚糖凝胶载体448

5．琼脂糖凝胶和交联琼脂糖凝胶载体448

1．多糖类载体活化451

三、载体活化及偶联451

2．分子臂的引入及双功能结合剂455

3．多孔玻璃载体的活化456

四、亲和吸附和洗脱459

五、亲和层析应用461

1．干扰素的提纯461

2．微管蛋白（Tubulin）的纯化462

3．DNP标记肽的纯化466

参考文献468

英汉名词对照469