《蛋白质电泳实验技术》求取 ⇩

第一章电泳概论1

1.1 电泳的早期历史2

1.2 电泳的简单原理6

1.3 电泳的大致分类8

1.4 凝胶电泳技术的历史9

参考文献10

第二章凝胶电泳的支持介质14

2.1 聚丙烯酰胺凝胶的形成和结构15

2.2 丙烯酰胺和N,N-甲叉双丙烯酰胺的纯化和毒性18

2.3 引发剂、增速剂和聚合20

2.4 聚丙烯酰胺凝胶的有效孔径和分子筛效应23

2.5 琼脂糖凝胶的性能、结构与特点25

2.6 电泳新介质32

参考文献35

第三章凝胶电泳仪器的进展38

3.1 电泳槽38

3.1.1 圆盘电泳39

3.1.2 垂直电泳41

3.1.3 水平电泳43

3.1.4 水平平板电泳的优点44

3.2 电源46

3.4 凝胶干燥器47

3.3 外循环恒温系统47

3.6 电泳转移48

3.5 各种灌胶模具48

3.7 电泳洗脱仪50

3.8 制备电泳仪50

3.9 凝胶扫描和摄录装置52

参考文献53

第四章常规聚丙烯酰胺凝胶电泳54

4.1 原理54

4.1.1 蛋白质的电泳行动54

4.1.2 原理55

4.1.3.1 pH的选择57

4.1.3 缓冲系统的选择57

4.1.3.2 离子强度的选择59

4.1.4 凝胶浓度的选择61

4.1.4.1 浓缩胶与分离胶62

4.1.4.2 浓缩胶的作用原理63

4.1.4.3 均一胶和梯度胶64

4.1.5 连续电泳和不连续电泳64

4.1.6 分子量测定66

4.2 方法69

4.2.1.1 垂直平板电泳的制胶70

4.2.1 制胶70

4.2.1.2 水平平板电泳的制胶73

4.2.2 样品的准备79

4.2.2.1 选择合适的样品缓冲液79

4.2.2.2 蛋白标准的准备79

4.2.2.3 样品浓度79

4.2.2.4 加样要求80

4.2.3 电泳80

4.2.3.1 垂直电泳80

4.2.3.2 水平电泳81

4.2.4.1 早期染色方法82

4.2.4 检测82

4.2.4.2 考玛斯亮蓝染色83

4.2.4.3 银染色87

4.2.4.4 其他染色方法91

4.2.4.5 一些蛋白的染色方法92

4.2.4.6 同工酶染色95

4.2.4.7 荧光探针法100

4.2.4.8 免疫方法102

4.2.4.9 电泳转移103

4.2.4.10 电泳后蛋白带的氨基酸分析103

4.2.5 照相,凝胶干燥104

4.2.6 定量测定105

4.3 实验考虑106

4.3.1 电泳方法和方式的选择106

4.3.2 最佳凝胶浓度和缓冲系统的选择106

4.3.3 凝胶聚合不佳的原因和对策107

4.3.4 样品的预处理108

4.3.5 阳极电泳和阴极电泳108

4.3.6 半干技术109

4.3.7 检测方法和选择111

4.3.8 电泳过程中的不正常现象和对策112

4.3.9 电泳结果的分析113

参考文献115

第五章SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳123

5.1 原理123

5.1.1 蛋白质分子的解聚123

5.1.2 缓冲系统的选择126

5.1.3 凝胶浓度的选择127

5.1.4 分子量测定128

5.1.4.1 分子量测定的理论背景128

5.1.4.2 蛋白标准129

5.1.4.3 分子量的计算130

5.1.5 低分子量多肽的SDS电泳131

5.2.1 制胶(用于垂直电泳或水平电泳)132

5.2 方法132

5.2.2 样品的准备137

5.2.2.1 样品缓冲液的配制137

5.2.2.2 蛋白标准的准备138

5.2.2.3 样品浓度和加样要求138

5.2.3 电泳138

5.2.3.1 垂直电泳138

5.2.3.2 水平电泳138

5.2.4 检测139

5.2.4.1 考玛斯亮蓝染色140

5.2.4.2 银染色141

5.2.4.3 其他染色方法144

5.2.4.4 荧光探针法145

5.2.4.5 电泳转移145

5.2.4.6 电泳后蛋白带的氨基酸组成和序列分析145

5.2.4.7 电泳后的肽图分析145

5.2.5 照相,凝胶干燥146

5.2.6 定量测定146

5.3 实验考虑146

5.3.1 SDS电泳是测定蛋白质亚基分子量的最佳选择146

5.3.2 凝胶浓度和缓冲系统的选择147

5.3.3 SDS-琼脂糖凝胶电泳148

5.3.4.1 阳离子去污剂149

5.3.4 去污剂的选择149

5.3.4.2 无离子去污剂150

5.3.4.3 酸-尿素去污剂150

5.3.4.4 电荷位移电泳150

5.3.5 样品的处理151

5.3.5.1 还原SDS处理151

5.3.5.2 带有烷基化作用(alkylation)的还原SDS处理152

5.3.5.3 非还原的SDS处理152

5.3.6 半干技术153

5.3.7 检测方法的选择154

5.3.8 生物活性的恢复154

5.3.8.1 在凝胶中恢复活性155

5.3.8.2 电泳转移后恢复生物活性156

5.3.8.3 洗脱后在自由溶液中恢复生物活性156

5.3.9 电泳过程中的不正常现象和对策156

5.3.10 电泳结果的分析156

参考文献157

第六章载体两性电解质pH梯度等电聚焦161

6.1 原理161

6.1.1 蛋白质的等电点161

6.1.2 等电聚焦—在pH梯度中的电泳162

6.1.3 等电聚焦的分辨率164

6.2.1 历史166

6.2 载体两性电解质和pH梯度的形成166

6.2.2.1 Ampholine的合成(瑞典LKB公司)167

6.2.2 合成167

6.2.2.2 Servalyte的合成(德国Serva公司)168

6.2.2.3 Pharmalyte的合成(瑞典Pharmacia公司)169

6.2.2.4 实验室合成170

6.2.2.5 中国军事医学科学院的载体两性电解质170

6.2.3 特性170

6.2.3.1 分子量小170

6.2.3.2 可溶性好171

6.2.3.5 紫外吸收低,不发荧光172

6.2.3.3 缓冲能力强172

6.2.3.4 导电性均匀172

6.2.3.6 容易从聚焦的蛋白带中除去173

6.2.3.7 无毒、无生物学效应173

6.2.3.8 螯合性质173

6.2.4 pH梯度的形成173

6.3 薄层分析等电聚焦的方法175

6.3.1 聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦175

6.3.1.1 制胶175

6.3.1.2 等电聚焦179

6.3.1.4 固定、染色、脱色180

6.3.1.3 pH梯度测定180

6.3.1.5 保存181

6.3.2 琼脂糖凝胶等电聚焦181

6.3.2.1 制胶181

6.3.2.2 等电聚焦183

6.3.2.3 pH梯度的测定183

6.3.2.4 固定,染色,脱色,保存184

6.4 实验考虑184

6.4.1 稳定介质的选择184

6.4.2 稳定介质的电内渗185

6.4.3 载体两性电解质和pH梯度范围的选择187

6.4.4 丙烯酰胺的聚合189

6.4.5 电极溶液191

6.4.6 四甲基乙二胺(TEMED)对丙烯酰胺凝胶的聚合和pH梯度的影响192

6.4.7 样品的预处理194

6.4.8 加样方法196

6.4.9 电参数(电压,电流,功率,温度和时间)197

6.4.10 pH梯度和pI的测定201

6.4.11 聚焦后的检测202

6.4.11.1 各种染色方法202

6.4.11.2 扫描与定量203

6.4.12.1 聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦204

6.4.12 聚焦过程中出现的问题及解决方法204

6.4.11.5 滴定曲线204

6.4.11.4 双向电泳204

6.4.11.3 电泳转移204

6.4.12.2 琼脂糖凝胶等电聚焦208

参考文献210

第七章固相pH梯度等电聚焦214

7.1 原理214

7.1.1 固相pH梯度介质的结构和合成214

7.1.2 Immobiline的物化特性219

7.1.3 固相pH梯度的原理223

7.1.3.1 Henderson-Hasselbalch公式223

7.1.3.2 一个pH范围的固相pH梯度224

7.1.3.3 窄范围和宽范围的pH梯度226

7.1.3.4 固相pH梯度的计算机模拟233

7.1.4 分辨率234

7.2 方法238

7.2.1 制胶238

7.2.1.1 选择pH范围:计算缓冲与滴定Immobiline的体积238

7.2.1.2 贮液配置239

7.2.1.3 模具组装和凝胶溶液的配制239

7.2.1.4 灌胶240

7.2.1.5 洗胶和吹胶240

7.2.2 等电聚焦241

7.2.4.1 各种染色方法242

7.2.3 pH梯度的测定242

7.2.4 检测242

7.2.4.2 凝胶干燥与保存243

7.2.4.3 扫描与定量243

7.2.4.4 双向电泳243

7.2.4.5 电泳转移243

7.3 实验考虑243

7.3.1 固相pH 梯度的优缺点243

7.3.2 pH范围的选择245

7.3.3 灌胶与聚合245

7.3.4 洗胶与干胶246

7.3.5 离子强度、缓冲能力和导电性247

7.3.6 电内渗248

7.3.7 蛋白质的可溶性和添加剂249

7.3.8 盐对固相pH梯度等电聚焦的影响251

7.3.9 电参数252

7.3.10 等电点的实验测定253

7.3.11 与质谱连用254

7.3.12 电泳过程中出现的问题和解决方法254

7.4 等电聚焦技术的进展255

7.4.1 第一代等电聚焦255

7.4.3 第三代等电聚焦256

7.4.2 第二代等电聚焦256

7.4.4 第四代等电聚焦257

参考文献258

第八章双向电泳262

8.1 概述262

8.1.1 O＇Farrell系统—ISO-DALT系统263

8.1.2 IPG-DALT系统264

8.2 方法265

8.2.1 ISO-DALT方法265

8.2.1.1 等电聚焦凝胶的准备265

8.2.1.4 pH梯度的测定266

8.2.1.2 样品的准备和加样266

8.2.1.3 等电聚焦266

8.2.1.5 平衡267

8.2.1.6 SDS凝胶的准备267

8.2.1.7 二向间的转移267

8.2.1.8 SDS电泳267

8.2.1.9 检测267

8.2.2 IPG-DALT方法268

8.2.2.1 固相pH梯度凝胶或凝胶条的准备268

8.2.2.2 溶液配制268

8.2.2.4 样品准备和加样269

8.2.2.3 凝胶的重新水化269

8.2.2.5 等电聚焦270

8.2.2.6 pH梯度的测定270

8.2.2.7 平衡270

8.2.2.8 SDS凝胶的准备270

8.2.2.9 二向间的转移270

8.2.2.10 SDS电泳271

8.2.2.11 检测271

8.3 实验考虑271

8.3.1 双向电泳的次序271

8.3.2 非平衡pH梯度电泳(NEPHGE)271

8.3.3 管状、垂直与水平方式的比较272

8.3.4 ISO-DALT和IPG-DALT274

8.3.5 样品的处理275

8.3.6 去污剂的影响278

8.3.7 聚焦参数278

8.3.8 IPG-DALT系统第一向电泳时的油层覆盖279

8.3.9 两向间的平衡和转移279

8.3.10 双向标准280

8.3.11 点的延长和扩散282

8.3.12 纹理现象282

参考文献283

9.1 概念287

第九章滴定曲线287

9.2 方法291

9.3 实验考虑291

9.3.1 在8mol/L尿素和去污剂中的滴定曲线291

9.3.2 大分子的滴定曲线292

9.3.3 用琼脂糖作为支持介质292

参考文献292

第十章免疫电泳294

10.1 原理295

10.1.1 免疫电泳基础295

10.1.2 单免疫扩散-Mancini技术295

10.1.3 双扩散-Ouchterlony技术296

10.1.4 Grabar和Williams免疫电泳298

10.1.5 “火箭”免疫电泳299

10.1.5.1 Laurell“火箭”免疫电泳299

10.1.5.2 融合“火箭”免疫电泳299

10.1.6 交叉免疫电泳301

10.1.6.1 Clarke 和Frccman交叉免疫电泳301

10.1.6.2 串联交叉免疫电泳301

10.1.7 反向免疫电泳303

10.2 方法303

10.2.1 溶液的准备303

10.2.4 电泳304

10.2.2 倒胶304

10.2.3 打孔与加样304

10.2.5 检测305

10.3 实验考虑305

10.3.1 支持介质305

10.3.2 缓冲系统306

10.3.3 抗体和抗血清306

10.3.4 方法的选择307

10.3.5 laying-on 技术307

10.3.6 媒介凝胶技术308

10.3.7 免疫沉淀的观察309

参考文献310

第十一章蛋白质印迹312

11.1 原理312

11.1.1 几种印迹方法313

11.1.1.1 点印迹313

11.1.1.2 扩散印迹314

11.1.1.3 溶剂流印迹314

11.1.1.4 电泳印迹315

11.1.2 固定化材料317

11.1.2.1 硝化纤维素膜317

11.1.2.2 尼龙膜317

11.1.2.3 DBM和DPT纸318

11.1.3 转移缓冲液319

11.1.4 封阻,标记和检测320

11.2 方法320

11.2.1 从SDS凝胶上转移蛋白320

11.2.1.1 溶液配置320

11.2.1.2 转移单元的组成321

11.2.2.1溶液配置322

11.2.2.2转移单元的组成322

11.2.2.3电参数322

11.2.2 从琼脂糖凝胶上转移蛋白322

11.2.1.3 电参数322

11.2.3 从等电聚焦凝胶上转移蛋白323

11.2.3.1 溶液配置323

11.2.3.2 转移单元的组成323

11.2.3.3 电参数323

11.2.4检测323

11.3 实验考虑324

11.3.1 电泳转移的效率324

11.3.2 转移缓冲液324

11.3.3 封阻326

11.3.4 探针327

11.3.5 总蛋白染色328

11.3.6.1 溶液和材料329

11.3.6 转移膜的塑料包埋和透明化329

11.3.6.2 操作330

11.3.7 垂直槽式和水平半干式电泳印迹330

11.3.8 印迹过程中出现的问题及解决办法331

参考文献333

第十二章制备电泳339

12.1洗脱339

12.1.1 扩散洗脱339

12.2.2 连续自由流动电泳340

12.2.3 空间电泳340

12.2 连续电泳340

12.2.1 连续洗脱电泳340

12.1.2 电泳洗脱340

12.3 等电聚焦制备电泳341

12.3.1 液体介质341

12.3.2 凝胶介质342

12.3.3 方法342

12.3.4 实验考虑345

12.3.5 固相pH梯度制备等电聚焦346

12.4 样品的均一性347

参考文献347