《现代分子生物学实验技术》求取 ⇩

1. 绪论1

1.1 分子生物学与基因工程一瞥1

1.1.1 Watson和Crick的DNA模板学说1

1.1.2 Monod和Jacob的操纵子学说4

1.1.3 基因工程的工具酶和载体6

1.1.4 基因工程的基本程序7

1.2 基因工程与分子生物学进展一览8

1.2.1 基因工程的研究成就8

1.2.2 分子生物学的研究成就20

1.3.1 蛋白质工程、改造基因、改造蛋白质、改造生命25

1.3 基因工程与分子生物学的发展趋势及展望26

1.3.2 分子生物电子学的兴起，以及不同学科的相互渗透26

1.3.3 走向海洋，走向宇宙空间27

1.3.4 大规模深入研究的重大战略部署的出现29

1.4 不结束语30

2. 分子生物学实验室常规仪器设备33

2.1 实验室的基本要求33

2.2.1 温度控制系统34

2.2 实验室的常规仪器及设施34

2.2.2 水的净化装置35

2.2.3 消毒设备35

2.2.4 计量系统35

2.2.5 其它设备36

2.3 离心机室的装备37

2.4 分析仪器室的设置38

2.4.1 电泳装置38

2.4.2 层析装置40

2.4.6 DNA合成仪42

2.4.3 光密度仪42

2.4.4 真空印迹系统42

2.4.7 DNA测定仪43

2.4.8 PCR仪44

2.5 核素实验室44

2.5.1 放射性核素操作实验室45

2.5.2 放射性核素测定室45

2.6 细胞培养室45

2.6.1 无菌操作设施46

2.6.3 观察和研究室47

2.6.2 温育和贮存区47

2.6.4 清洗和消毒48

2.7 暗室48

2.8 冷室49

3. 分子生物学实验室常用技术50

3.1 核酸的纯化50

3.1.1 酚/氯仿抽提核酸溶液的制备50

3.1.2 酚的重蒸馏与水饱和51

3.2.1 固体聚乙二醇吸水浓缩法52

3.2 核酸的浓缩52

3.2.2 丁醇抽提浓缩法53

3.3 核酸的沉淀53

3.3.1 核酸沉淀的盐类及浓度53

3.3.2 核酸沉淀的温度与时间54

3.3.3 离心力与时间55

3.3.4 有机沉淀剂55

3.3.5 核酸沉淀的操作方法56

3.4 核酸的定量58

3.4.2 荧光分光光度法测定核酸浓度59

3.4.1 分光光度法测定核酸的浓度59

3.5 核酸的贮存60

3.6 限制性内切酶及其应用61

3.6.1 限制性内切酶的功能、分类及命名61

3.6.2 限制性内切酶的数量单位及质量控制62

3.6.3 限制性内切酶酶解体系的建立63

3.6.4 限制性内切酶酶解中常见的问题和解决措施65

3.6.5 限制性内切酶的星号活力67

3.6.6 限制性内切酶的底物位点优势效应68

3.6.7 琼脂糖包埋完整染色体DNA的内切酶酶解69

3.6.9 限制性内切酶位点上的甲基化70

3.6.8 限制性内切酶对单链DNA的切割70

3.7 电泳71

3.7.1 原理71

3.7.2 影响电泳动率的四大因素72

3.7.3 核酸电泳的指示剂与染色剂74

3.7.4 电泳装置77

3.7.5 聚丙烯酰胺凝胶电泳77

3.7.6 琼脂糖凝胶电泳80

3.7.7 脉冲场凝胶电泳84

3.8 超速离心分离技术87

3.8.1 离心分离物质的原理87

3.8.2 超速离心的分类88

3.7.8 双相电泳88

3.8.3 超速离心在核糖分离中的应用89

3.9 柱层析90

3.9.1 排阻层析91

3.9.2 亲和层析92

3.9.3 羟基磷灰石柱层析93

3.9.4 离子交换层析93

3.9.5 反相层析93

4.1 核酸分离提取的原则95

4. 核酸的分离与纯化95

4.2 真核细胞染色体DNA的制备96

4.3 质粒和噬菌体DNA的提取与纯化105

4.3.1 质粒DNA的提取与纯化105

4.3.2 质粒DAN的小量制备107

4.3.3 质粒DNA的大量制备111

4.3.4 质粒DNA的纯化113

4.3.5 噬菌体DNA的提取与纯化118

4.4.2 DEAE纤维素纸插片电泳法124

4.4.1 从琼脂糖凝胶中回收DNA片段的原则124

4.4 DNA片段的分离及纯化124

4.4.3 电泳洗脱法126

4.4.4 低熔点琼脂糖凝胶挖块回收法131

4.4.5 玻璃粉末洗脱DNA131

4.4.6 琼脂糖凝胶中回收DNA片断的纯化132

4.4.7 聚丙烯酰胺凝胶中回收DNA片段133

4.4.8 蔗糖梯度超速离心分离DNA片段134

4.5 RNA的分离与纯化(真核细胞RNA的制备135

4.5.1 创造一个无RNase的环境136

4.5.2 RNA提取的方法139

4.5.3 mRNA的分离与纯化149

5. 核酸分子探针的标记155

5.1 概述155

5.1.1 探针的种类及其选择155

5.1.2 各种标记物及其选择159

5.1.3 放射性核素的探测162

5.1.4 放射性核素的卫生防护162

5.1.5 各种标记方法及其选择163

5.2 探针的放射性核素标记法163

5.2.1 切口平移法163

5.2.2 随机引物法167

5.2.3 单链DNA探针的标记170

5.2.4 cDNA探针的标记172

5.2.5 RNA探针的制备与标记175

5.2.6 DNA探针的末端标记178

5.2.7 寡核苷酸探针的标记187

5.2.8 碘放射性核素标记法188

5.3 非放射性标记法189

5.3.1 酶促标记法189

5.3.2 化学标记法189

5.4.1 凝胶过滤柱层析法194

5.4 探针的纯化194

5.4.2 反相柱层析法195

5.4.3 乙醇沉淀法196

5.5 探针比放射活性的测定196

5.5.1 三氯乙酸沉淀法196

5.5.2 DE-81滤膜吸附法197

6. 核酸分子杂交198

6.1 膜上印迹杂交198

6.1.1 印迹技术198

6.1.2 固-液相杂交技术211

6.1.3 杂交信号的检测218

6.1.4 滤膜的重复使用222

6.2 液相杂交技术222

6.2.1 核酸酶S1保护分析法222

6.2.2 RNA酶保护分析法224

6.3 核酸原位杂交及其应用225

6.3.1 核酸原位杂交的基本原理225

6.3.2 核酸原位杂交的基本操作方法229

6.4.1 亲和捕捉法236

6.4 新技术简介236

6.4.2 夹心杂交法237

6.4.3 链取代法238

7. 基因克隆239

7.1 基因工程诞生的历史背景239

7.2 基因克隆的策略与技术路线240

7.2.1 通过建立基因库分离靶基因240

7.2.2 通过载体在适当宿主中扩增240

7.3 目的基因的来源与产生241

7.4 克隆的载体242

7.4.1 质粒载体242

10.2 末端终止法测定DNA核苷酸序列243

7.4.2 λ噬菌体载体248

7.4.3 粘粒252

7.4.4 丝状噬菌体载体256

7.4.5 真核细胞的克隆载体258

7.5 DNA分子的体外连接264

7.5.1 DNA连接酶及连接机制264

7.5.2 DNA浓度对连接产物构型的影响267

7.5.3 DNA分子连接的策略与方案270

7.5.4 一种快速DNA连接技术286

7.6 重组子导入受体细胞287

7.6.1 概述287

7.6.2 转化方法288

7.7 重组子的筛选与鉴定292

7.7.1 针对遗传表型改变筛选方法293

7.7.2 分析重组子结构特征的筛选法294

7.8 亚克隆技术298

8. 基因组文库303

8.1 构建基因组文库的载体303

8.2 λ噬菌体载体304

8.2.1 应用λ噬菌体构建基因文库的基本步骤304

8.2.2 几种λ噬菌体载体305

8.3 载体DNA的制备310

8.3.1 载体DNA的酶解310

8.3.2 酶切后载体的再连接及包装后的滴度检测312

8.3.3 载体臂的纯化312

8.3.4 载体的脱磷处理314

8.3.5 Lamd GEM11/Lamda GEM12 BamHI.Xhol酶切后载体臂的部分填充314

8.4 真核细胞DNA的制备315

8.4.1 几种染色体DNA的提取法方315

8.4.2 限制性内切酶部分酶解高分子量真核DNA318

8.5 连接和包装320

8.5.1 连接浓度320

8.5.2 连接条件的确定322

8.5.3 包装抽提物的制备和体外包装323

8.6 基因组文库的保存和扩增327

8.7 粘性质粒为载体的基因文库328

9.1.1 mRNA的分离330

9.1 概述330

9. cDNA文库330

9.1.2 cDNA第一链的合成331

9.1.3 cDNA第二链的合成331

9.1.4 cDNA与载体连接332

9.1.5 噬菌体的包装，转染及质粒DNA的转化334

9.2 cDNA库的构建335

9.2.1 mRNA分离335

9.2.2 第一链的合成335

9.2.3 第二链的合成336

9.2.5 cDNA与连接子的连接337

9.2.6 cDNA的分部分离337

9.2.8 计算克隆的效率338

9.2.4 cDNA的甲基化338

9.2.7 cDNA的克隆338

9.2.9 cDNA库的扩增339

10. DNA序列测定340

10.1 概述340

10.1.1 末端终止法340

10.1.2 化学裂解法341

10.2.1 末端终止法测定DNA序列所需的关键试剂343

10.2.2 末端终止法测定DNA序列方法的选择344

10.2.3 大片段待测DNA片段的定向连续次级克隆344

10.2.4 用噬菌体M13克隆待测DAN片段349

10.2.5 双脱氧末端终止法352

10.2.6 变性聚丙烯酰胺凝胶制备355

10.2.7 测序产物的凝胶电泳356

10.2.8 Taq DNA聚合酶催化的测序反应及凝胶的银染色法357

10.3 Maxam-Gilbert化学法测定DNA序列360

10.3.1 待测DNA的纯化360

10.3.2 碱基的特异性修饰及裂解361

10.3.3 测序图谱的识读364

11 外源基因在原核细胞中的表达365

11.1 原核生物基因表达的特点365

11.2 外源基因在原核细胞中表达的重要调控元件366

11.2.1 启动子366

11.2.2 SD顺序369

11.2.3 终止子370

11.3.1 非融合型表达蛋白载体pKK223-3371

11.3 几种类型的原核表达载体371

11.3.2 分泌型克隆表达载体PINⅡ系统372

11.3.3 融合蛋白表达载体pG-EX系统373

11.4 用于原核细胞表达的外源基因374

11.5 提高外源基因表达的措施374

11.5.1 提高翻译水平374

11.5.2 减轻细胞的代谢负荷，提高外源基因的表达水平375

11.5.3 提高表达蛋白的稳定性、防止其降解376

11.6 关于包含体377

11.7 有关的实验378

11.7.1 外源基因的诱导表达379

11.7.2 细菌的裂解379

11.7.3 包含体的分离380

11.8 蛋白质的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳381

11.9 表达产物的免疫学及生物活性检测387

12. 外源基因在真核细胞中的表达389

12.1 哺乳动物基因转移的遗传选择标记389

12.1.1 胸苷激酶基因(tk)选择系统389

12.1.2 二氢叶酸还原酶基因(dhfr)选择系统390

12.1.3 新霉素抗性选择系统390

12.1.4 氯毒素乙酰转移酶基因检测系统390

12.2 外源基因导入哺乳动物细胞的载体390

12.2.1 SV40载体391

12.2.2 其它病毒载体392

12.3 外源DNA导入哺乳动物细胞的方法393

12.3.1 磷酸钙转染技术394

12.3.2 电穿孔转染技术396

12.3.3 基因显微注射技术397

12.3.4 脂质体载体法397

12.3.5 DEAE-葡聚糖转染技术398

12.4 基因表达产物的检测399

12.4.1 免疫荧光抗体法检测表达蛋白399

12.4.2 免疫沉淀法检测表达蛋白400

12.4.3 Western印迹检测表达蛋白质403

13. 多聚酶链式反应(PCR)技术408

13.1 PCR技术的原理408

13.2 PCR反应的成分和作用409

13.2.1 PCR反应的缓冲液409

13.2.3 PCR反应的酶及其浓度410

13.2.2 底物浓度410

13.2.4 引物411

13.2.5 PCR反应条件的选择411

13.2.6 PCR反应的产物积累规律412

13.3 PCR反应的自动化412

13.4 PCR反应引物设计412

13.5 耐热DNA多聚酶413

13.6 PCR反应模板的准备415

13.7 几种特殊的PCR417

13.7.1 锚定PCR417

13.7.2 不对称PCR417

13.7.4 多重PCR418

13.7.3 反向PCR418

13.8 PCR技术的应用419

13.8.1 遗传性疾病的基因诊断419

13.7.5 着色互补PCR419

13.8.2 PCR反应在检测艾滋病中的应用423

13.8.3 检测癌基因425

13.8.4 PCR在法医学上的应用427

13.8.5 PCR技术在分子生物学中的其它应用429

14. DNA的化学合成435

14.1 DNA化学合成原理437

14.2 DNA的合成纯化及鉴定438

14.2.1 DNA合成仪的操作438

14.2.4 寡核苷酸片段的鉴定440

14.2.4 合成产物中DNA含量的测定440

14.2.2 DNA的切落及去保护440

14.2.3 寡核苷酸片段的纯化440

14.3 DNA化学合成的应用441

14.3.2 DNA合成在基因表达和调控方面的应用443

14.3.3 合成基因在医学中的应用443

14.3.1 DNA合成在基因工程和分子生物学研究中的应用444

15. 真核基因表达调控445

15.1 真核基因表达调控基本理论445

15.1.1 真核基因结构功能特点445

15.1.2 真核基因表达调控的策略446

15.1.3 转录前的表达调控446

15.1.4 转录水平的调控450

15.1.5 转录后水平的调控462

15.1.6 翻译水平的调控464

15.1.7 翻译后水平的调控465

15.2 基因表达调控研究方法465

15.2.1 DNase I超敏感性分析465

15.2.2 DNA甲基化分析466

15.2.3 转录起始位点的测定468

15.2.4 体外转录470

15.2.5 进行中的核转录分析472

15.2.6 差示文库473

15.2.7 氯毒素乙酰转移酶分析475

15.2.8 凝胶滞留法479

15.2.9 滤膜结合法483

15.2.10 Southwestern印迹485

15.2.11 足纹法490

15.2.12 蛋白--核酸紫外交联法509

15.2.13 DNA结合蛋白的分离纯化511

15.2.14 编码DNA结合蛋白的cDNA克隆的筛选513

16 转基因动物518

16.1 转基因方法518

16.2 微注射DNA的制备与纯化520

16.2.1 DNA影响基因转移的因素520

16.2.2 显微注射DNA样品的制备520

16.3 鼠的种类与饲养521

16.3.1 鼠的种类521

16.3.2 鼠的安置与饲养522

16.4.1 超排卵523

16.4.2 取卵523

16.4 超排卵与取卵523

16.5 显微注射525

16.5.1 制备持卵管与注射针525

16.5.2 显微注射操作527

16.6 卵的转移529

16.6.1 输卵管转移529

16.6.2 子宫转移531

16.7.2 从胎鼠肌肉或幼鼠尾巴提取大分子量DNA532

16.7.3 转基因鼠中外源DAN的分析532

16.7.1 取鼠胚胎532

16.7 转基因鼠系的建立532

16.7.4 转基因鼠系533

16.8 卵培养液的配制与保存533

16.8.1 配制M2与M16的培养液的贮存液533

16.8.2 由贮存液配制M2534

16.9 转基因动物的应用535

16.9.1 基因表达调控535

16.8.3 由贮存液配制M16536

16.9.2 转基因动物模型539

16.9.3 用转基因动物生产生物活性物质与药物540

17. 人类基因治疗542

17.1 基因治疗概述542

17.2.1 反转录病毒543

17.2 基因转移系统543

17.2.2 腺病毒545

17.2.3 腺病毒伴随病毒545

17.2.4 单纯疱疹病毒546

17.2.5 脂质体546

17.2.6 受体介导的蛋白546

17.3 受体细胞与转移基因的表达547

17.3.1 造血细胞547

17.3.2 肌肉细胞548

17.3.3 成纤维细胞548

17.3.4 肝细胞548

17.4 人类基因治疗的审批程序549

17.3.5 其他细胞549

17.5 基因标记与基因治疗550

17.6 遗传病基因治疗551

17.6.1 腺苷脱氨酶缺陷552

17.6.2 血友病553

17.7 肿瘤基因治疗553

17.8 临床基因治疗概览554

17.9 伦理学安全性与社会效应556

17.10 问题与展望557

附录560

1. 常用限制性内切酶酶切位点560

2. 放射性核素数据563

3. 离心机转速与离心力的换算564

4. 核酸及蛋白质数据565

5.1 常用缓冲液的pKa值571

5. 分子克隆中使用的试剂与常用缓冲液的配制571

5.2 各种pH值的Tris缓冲液的配制572

5.3 常见的市售酸碱的浓度573

5.4 各种浓度的酸碱贮存液的近似pH值573

5.5 分子克隆常用缓冲液574

5.6 磷酸缓冲液574

5.7. 电泳缓冲液575

6. 常用贮存液的配制578

7.2 蛋白水解酶585

7.4 无RNA酶的DAN酶585

7.3 无DNA酶的RNA酶585

7.1 溶菌酶585

7. 常用酶的配制585

8. 常用层析数据587

9. 细菌培养基、抗生素和菌株590

9.1 液体培养基590

9.2 含有琼脂或琼脂糖的培养基592

9.3 保存培养基593

9.4 抗生素594

9.5 用于λ噬菌体操作的溶液594

9.6 细菌菌株一览表595

9.7 常见大肠杆菌菌株遗传标记603

英汉分子生物学词汇605

索引650