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第一章 抗原的制备技术1

第一节 天然抗原的提取与纯化1

一、抗原的提取1

二、抗原的分离与纯化2

三、纯化抗原的浓缩和保存3

四、纯化抗原的鉴定4

第二节 人工免疫原的制备4

一、载体的类型4

二、偶联剂与连接方法4

第三节 合成肽抗原的制备5

一、肽的合成与纯化5

二、免疫原性肽的选择6

三、载体蛋白的选择7

四、连接方法的选择7

五、合成肽与载体蛋白的连接8

六、应用溴乙酰化制备环状、聚合肽及肽-载体结合物12

第四节 基因工程抗原的制备14

第五节 免疫刺激复合物作为佐剂的制备14

第二章 抗体的制备技术16

第一节 多克隆抗体的制备16

一、免疫动物16

二、抗血清的鉴定17

三、抗血清的保存18

四、抗合成肽类抗体的制备18

第二节 杂交瘤技术制备单克隆抗体19

一、细胞融合杂交瘤技术制备McAb的基本原理19

二、骨髓瘤细胞的选择20

三、小鼠B淋巴细胞杂交瘤技术20

四、人McAb的制备26

第三节 双特异性抗体的制备28

第四节 抗体分子片段的制备30

一、IgG分子片段的制备30

二、IgM分子片段的制备32

第五节 抗体的纯化32

一、沉淀法33

二、辛酸提取法33

三、离子交换法34

四、高效液相色谱法36

五、亲和层析法36

六、IgM的纯化38

七、IgA的纯化38

第三章 基因工程抗体技术41

第一节 人-鼠嵌合抗体41

二、轻、重链抗体嵌合基因共转染受体细胞43

一、嵌合基因的构建43

第二节 人源化抗体44

第三节 小分子抗体47

一、原理48

二、构建50

第四节 抗体库技术51

一、抗体库技术概述51

二、噬菌体呈示载体的构建53

三、PCR引物的设计54

四、抗体库的构建56

第五节 基因工程抗体的表达、纯化及活性测定59

一、载体的构建及抗体的表达60

二、抗体的纯化62

三、抗体活性及亲和力的测定63

一、基本原理65

第一节 抗原抗体反应的基本原理65

第四章 抗原抗体反应65

二、抗原抗体反应的特点66

三、抗原抗体反应的影响因素67

第二节 经典的抗原抗体反应68

一、凝集反应68

二、沉淀反应73

三、补体结合反应77

四、中和试验77

第三节 免疫电泳技术79

一、免疫电泳79

二、对流免疫电泳80

三、火箭免疫电泳81

四、免疫固定电泳82

五、交叉免疫电泳83

二、补体结合试验85

第四节 补体参与的抗原抗体反应85

一、溶血试验85

三、免疫粘附试验88

第五节 免疫微粒技术90

一、胶乳微粒免疫检测技术90

二、免疫磁性微粒分离与纯化技术92

三、微粒技术在分子生物学研究中的应用92

第五章 免疫标记技术94

第一节 免疫荧光技术94

一、经典的免疫荧光技术94

二、现代免疫荧光分析技术99

第二节 放射免疫技术104

一、放射免疫测定104

二、免疫放射测定108

三、放射受体分析111

第三节 免疫酶技术112

一、酶标抗体的制备与质量鉴定112

二、非均相(或异相)酶免疫测定116

三、均相酶免疫测定123

第四节 免疫电镜技术126

一、免疫电镜技术常用标记物及其制备方法126

二、免疫电镜技术的不标记抗体法129

第五节 胶体金标记技术131

一、基本原理131

二、胶体金的制备131

三、胶体金标记蛋白的制备133

四、胶体金标记技术在免疫学试验中的应用135

第六节 生物素与亲合素标记技术137

一、生物素与亲合素的生物学特性137

二、生物素标记技术138

三、亲合素标记技术140

四、生物素-亲合素系统的试验方法和原理141

五、生物素-亲合素系统的实验应用142

第七节 化学-生物发光及发光免疫分析145

一、化学发光与生物发光145

二、发光标记物和发光标记技术149

三、发光免疫分析技术154

第六章 免疫组织化学技术162

第一节 免疫荧光细胞化学技术162

一、免疫荧光染色方法162

二、对照染色的设立164

三、非特异性荧光及其消除方法164

四、免疫荧光染色中的几个问题165

第二节 免疫酶细胞化学技术165

一、酶标记抗体免疫组化染色法165

二、非标记抗体免疫酶组化染色法166

三、免疫酶组化技术中常用的酶显色底物168

第三节 亲合组织化学技术169

一、生物素-亲合素技术169

二、葡萄球菌A蛋白的应用170

三、凝集素170

四、链霉亲合素-生物素技术171

第四节 免疫金银及铁标记免疫组化技术172

一、免疫金染色法172

二、免疫金银染色法172

三、彩色免疫金银法173

四、免疫胶体铁细胞化学技术173

第七章 流式细胞术(FCM)在生物医学中的应用175

第一节 流式细胞术发展简史175

一、流式细胞术仪器的发展175

一、概述176

二、流式细胞术的工作原理176

二、流式细胞术方法学的发展176

第二节 流式细胞术的工作原理176

三、流式细胞术的技术特点178

四、流式细胞术可检测的细胞参数178

五、影响流式细胞术定量分析的因素179

第三节 流式细胞术的荧光染色、检测和分析179

一、概述179

二、流式细胞术的荧光染色180

三、样品的流式细胞术检测和分析183

四、流式免疫荧光技术的应用186

五、几种流式免疫荧光技术的具体方法187

第四节 流式细胞分选术191

一 、分选方式191

一、细胞膜电位的测定193

二、激光流式分选条件的选择193

第五节 流式细胞术对细胞膜定位、细胞内钙离子和pH值的测定193

二、细胞内钙离子的流式细胞术测定194

三、FCM测定细胞内pH值194

第六节 流式细胞术对细胞DNA的测定195

一、流式细胞术DNA检测的组织来源195

二、常用于流式细胞术DNA检测的荧光染料195

三、流式DNA定量分析的染色原理196

四、定量分析DNA的染色方法197

五、细胞DNA检测的内参考标准198

六、定量荧光细胞染色技术的评价标准198

七、DNA直方图引伸的主要参数199

第八章 免疫球蛋白及其他免疫相关蛋白的测定201

第一节 免疫球蛋白测定201

一、IgG、IgA、IgM的测定201

三、IgE的测定206

二、IgD的测定206

四、异常免疫球蛋白的测定208

第二节 常见自身抗体的检测原则与方法210

一、抗甲状腺球蛋白抗体的检测211

二、抗甲状腺过氧化物酶抗体检测212

三、抗心磷脂抗体检测212

四、抗肝特异性脂蛋白抗体检测213

五、抗平滑肌抗体检测214

六、抗线粒体抗体检测214

七、类风湿因子测定215

八、抗核抗体检测216

九、抗双链DNA抗体检测216

十、ENA多肽抗体谱检测217

十一、抗中性粒细胞胞浆抗体测定218

十二、抗组蛋白抗体测定219

十四、抗子宫内膜抗体检测220

十三、抗精子抗体检测220

十五、抗卵巢抗体检测221

十六、抗透明带抗体检测221

十七、抗乙酰胆碱受体抗体检测222

十八、特异性神经元抗核抗体检测223

第三节 血清中其他免疫相关蛋白的测定224

一、急性反应期蛋白测定224

二、β2-微球蛋白测定225

三、肌红蛋白测定226

四、纤维连接蛋白测定227

五、α2巨球蛋白测定228

六、甲状腺球蛋白测定229

七、溶菌酶测定230

一、血清补体总活性的测定232

第九章 补体测定技术232

第一节 补体总活性的测定232

二、补体旁路途径溶血活性的测定233

第二节 补体各成分的测定234

一、溶血法235

二、免疫化学法236

第三节 补体裂解产物的测定237

一、C3裂解产物的检测237

二、C5裂解产物的检测239

三、ELISA检测补体终末复合物SCb-9或MC5b-9240

第四节 补体遗传多态性的检测241

一、补体C4遗传多态性的检测241

二、补体C2遗传多态性的检测243

三、补体B因子(Bf)遗传多态性的检测244

第一节 循环免疫复合物的测定246

第十章 免疫复合物的测定246

一、聚乙二醇(PEG)沉淀试验247

二、PEG沉淀补体消耗试验248

三、抗补体试验249

四、SPA夹心ELISA试验250

五、细胞受体结合免疫测定法251

第二节 特异性循环免疫复合物的测定252

一、胰蛋白酶解离法检测HBsAg-CIC252

二、捕获法ELISA检测肾综合征出血热Ag/IgE和Ag/IgD-CIC253

三、捕获法ELISA检测HBsAg/C3-CIC253

四、捕获法ELISA检测甲型肝炎Ig/C3-CIC253

第三节 局部免疫复合物的测定254

第十一章 细胞因子及其受体的检测255

第一节 细胞因子受体的测定255

二、IL-2R的检测256

一、细胞因子受体检测的基本技术256

第二节 可溶性及膜结合型白介素的测定258

一、IL-1的检测258

二、IL-2的诱生与测定261

三、IL-3的检测263

四、IL-4的检测265

五、IL-5的检测267

六、IL-6的检测268

七、IL-7的检测269

八、IL-8的检测270

九、IL-9的测定271

十、IL-10的测定271

十一、IL-11的测定272

十二、IL-12的测定273

十三、白介素其他成员的检测274

一、IFN-α和IFN-β的诱生和测定275

第三节 干扰素的测定275

二、IFN-γ的诱生和测定277

第四节 干细胞因子的检测278

一、UT-7细胞增殖法278

二、MC/9细胞增殖法278

三、放射受体测定278

第五节 转化生长因子-β的测定279

一、胸腺细胞增殖法279

二、放射受体测定法280

第六节 集落刺激因子的测定280

一、CSF的诱生280

二、CSF的检测281

第七节 肿瘤坏死因子测定281

一、生物学活性检测法281

二、TNF的免疫学检测法283

三、TNF的类型检测284

第八节 细胞因子基因的测定284

一、细胞因子的DNA检测284

二、细胞因子mRNA表达的测定285

第十二章 免疫细胞的分离与功能检测288

第一节 外周血单个核细胞的分离与纯化288

一、外周血单个核细胞的分离288

二、淋巴细胞的纯化290

第二节 外周血淋巴细胞的选择性分离291

一、T细胞的分离291

二、T细胞亚群的分离293

三、B细胞的分离295

四、NK细胞及LAK前体细胞的分离296

第三节 淋巴细胞亚群的检测296

一、免疫荧光技术296

二、微量细胞毒试验297

三、花环技术298

四、免疫酶染色技术299

第四节 淋巴细胞功能测定300

一、淋巴细胞增殖反应试验301

二、淋巴细胞多克隆抗体产生的测定303

三、特异性抗原刺激人体内、外抗体产生的测定306

四、多克隆及抗原特异性细胞毒性T细胞功能的测定306

五、LAK/TIL细胞的制备与活性测定307

六、NK细胞活性测定309

第五节 中性粒细胞的分离与功能测定312

一、中性粒细胞的分离方法312

二、中性粒细胞的功能测定313

第六节 单核-巨噬细胞的分离与功能测定315

一、人单核细胞的分离方法315

二、单核-巨噬细胞的功能测定316

一、嗜碱性粒细胞的分离方法319

第七节 嗜碱性粒细胞的分离与功能测定319

二、嗜碱性粒细胞的功能测定--嗜碱性粒细胞颗粒试验320

第八节 组织肥大细胞的分离321

第九节 粘附分子的测定321

一、可溶性粘附分子的测定321

二、细胞膜上粘附分子的测定322

第十节 红细胞免疫功能的测定323

一、红细胞C3b受体花环及免疫复合物花环试验323

二、红细胞的SPA-酵母菌混合花环试验324

三、单克隆抗体Coombs试验324

四、血清中红细胞免疫调节因子活性的测定325

五、红细胞增强白细胞吞噬功能的简易形态学方法325

六、红细胞对肿瘤细胞免疫粘附能力的测定方法326

七、红细胞促淋巴细胞与中性粒细胞对肿瘤细胞免疫粘附能力的测定326

一、鼠脾、胸腺和淋巴结单个核细胞的分离328

第十三章 实验动物免疫细胞功能的测定328

第一节 鼠单个核细胞的分离纯化328

二、T细胞和B细胞的分离纯化329

三、树突状细胞的分离330

第二节 鼠T细胞功能的测定331

一、鼠T细胞增殖试验331

二、细胞毒性T细胞活性的诱导及测定332

三、T细胞功能的定量测定(有限稀释法)335

四、胚胎胸腺细胞培养与T细胞分化发育336

五、小鼠体内T细胞功能测定338

第三节 鼠B细胞功能的测定339

一、小鼠B细胞增殖试验339

二、体内、外抗体合成的测定340

二、细胞凋亡与细胞坏死的区别342

一、细胞凋亡的基本概念342

第一节 细胞凋亡的概念342

第十四章 细胞凋亡及其检测方法342

三、研究细胞凋亡的意义343

第二节 细胞凋亡的检测方法344

一、形态学方法344

二、生物化学方法345

三、免疫学方法346

四、原位末端转移酶标记技术347

五、靶细胞DNA片段的定量分析与杀伤细胞介导的细胞溶解试验348

六、流式细胞分析术349

第十五章 免疫细胞内信息传递的检测353

第一节 免疫细胞磷脂酰肌醇转换的分析353

一、用Dowex阴离子交换层析分离［3H］-磷酸肌醇353

二、HPLC分离磷酸肌醇354

三、薄层层析(TLC)分离肌醇磷脂355

第二节 细胞内Ca2+浓度的测定356

第三节 蛋白激酶C的活性测定357

第四节 细胞内环核苷酸浓度的测定358

第五节 磷酸化蛋白的研究分析359

一、正磷酸盐标记细胞360

二、磷酸化氨基酸分析361

第六节 抗磷酸化酪氨酸印迹技术362

一、用AP显色系统检测362

二、125I-标记的SPA检测法363

第十六章 细胞培养技术365

第一节 实验室一般条件和工作规则365

一、实验室的一般条件365

二、实验室的一般工作规则368

第二节 细胞培养的基本条件368

第三节 原代细胞培养369

第四节 传代细胞培养370

第五节 HTLV-转化细胞培养371

一、HTLV-1型或2型转化人T细胞的方法372

二、注意事项372

第六节 EBV转化细胞的培养373

一、EBV的制备373

二、靶细胞的制备373

三、EBV转化靶细胞373

第七节 T细胞克隆技术374

一、抗原特异性T细胞克隆的制备374

二、抗原非特异性T细胞克隆的制备374

三、鼠T细胞克隆的制备375

第八节 T细胞杂交瘤技术376

一、淋巴瘤细胞系的选择376

第九节 控制和清除细胞培养中的污染377

四、T细胞杂交瘤的筛选377

三、饲养细胞的选择与制备377

二、特异性T细胞的制备与活化377

一、抗菌素的应用378

二、细菌和真菌污染的处理378

三、培养细胞污染支原体的检测和处理378

第十七章 HLA分型技术381

第一节 血清学分型技术381

一、淋巴细胞分离法381

二、HLA-A、B、C、DR、DQ抗原分型法382

第二节 细胞学分型技术383

一、HLA-D抗原的测定383

二、HLA-DP抗原的测定383

第三节 DNA分型技术384

一、PCR-SSP384

三、PCR-SSCP386

二、PCR-RFLP386

四、PCR-SSO387

第十八章 蛋白质的分离和分析技术389

第一节 淋巴细胞膜蛋白的制备389

一、非离子型去污剂提取淋巴细胞膜蛋白390

二、匀浆器制备膜蛋白391

第二节 应用抗体分离蛋白质392

一、免疫亲和层析392

二、免疫沉淀法394

第三节 蛋白质的电泳分离397

一、聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分离的基本原理和重要参数397

二、蛋白质的单向凝胶电泳398

三、双向凝胶电泳系统402

四、对角凝胶电泳(Diagonal凝胶电泳)404

五、用于微序列分析的蛋白质分离方法404

六、染色凝胶中蛋白质的分离纯化406

一、凝胶蛋白染色408

第四节 蛋白质的测定408

二、免疫印迹法410

三、可溶性或膜结合型蛋白质的碘标记412

四、蛋白质的生物合成标记技术413

第十九章 免疫学中常用的基因克隆与表达技术417

第一节 RAN的制备和分析417

一、RNA的提取417

二、RNA的Northern杂交分析421

第二节 DNA的分离与纯化423

一、从液相中分离、纯化、浓缩DNA423

二、哺乳动物细胞基因组DNA的制备424

三、细菌质粒DNA的制备425

第三节 DNA片段的分离与回收426

一、尼龙膜Southern杂交(同位素标记)430

第四节 基因组DNA的分析430

二、地高辛(非同位素)标记432

第五节 DNA的限制性内切酶酶切、连接与转化433

一、DNA的限制性内切酶酶切433

二、DNA分子的体外连接434

三、重组质粒的转化434

四、质粒DNA阳性克隆的筛选435

第六节 DNA序列测定435

一、测序反应原理436

二、体外扩增DNA的直接测序(PCR测序技术)436

三、同位素标记法测序439

四、银染色法测序440

五、荧光标记法测序442

第七节 克隆DNA的转染和表达443

一、磷酸钙共转染法444

二、DEAE-葡聚糖转染法446

三、电穿孔转染448

四、脂质体介导的转染449

五、哺乳动物细胞的稳定基因转染450

六、克隆基因的表达451

第二十章 原位分子杂交技术454

第一节 概述454

一、核酸分子杂交的基本原理454

二、基本方法455

三、探针的种类456

第二节 探针的标记技术456

一、同位素标记456

二、生物素标记457

三、地高辛标记457

四、荧光素标记458

五、联合标记459

六、常用的探针标记技术459

第三节 原位杂交组化技术462

一、组织切片与培养细胞原位杂交技术462

二、PCR与原位杂交技术464

三、电镜水平的原位杂交技术465

四、原位杂交与免疫细胞化学结合法467

第二十一章 免疫学中常用的PCR技术471

第一节 PCR技术原理471

第二节 PCR反应体系的组成及其条件的优化472

一、模板核酸472

二、寡聚核苷酸引物472

五、Mg2+的浓度473

六、耐热DNA聚合酶473

四、三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)473

三、PCR反应缓冲液473

七、循环参数474

八、防止污染的对策474

九、PCR常见问题及处理475

十、扩增的忠实性475

第三节 PCR分类475

一、典型PCR，以DNA为模板475

二、逆转录PCR(RT-PCR)476

三、免疫PCR(IM-PCR)476

第四节 不同来源标本DNA的PCR扩增477

一、PCR扩增模板DNA的制备477

二、以DNA为模板的PCR扩增477

第五节 定量PCR478

一、内参照定量PCR478

二、竞争PCR作mRNA定量479

第六节 免疫PCR(IM-PCR)481

一、DNA的生物素标记481

二、免疫PCR操作步骤481

三、注意事项482

第七节 PCR在淋巴细胞抗原受体研究中的应用483

一、 应用PCR扩增T细胞受体基因重排483

二、用PCR检测白血病时T细胞受体β链基因重排484

三、应用锚定PCR技术对T细胞受体δ链进行分析484

四、PCR扩增免疫球蛋白重链的CDR3基因486

中英对照专业词汇500

附录500

一、核酸、蛋白质常用数据及其换算500

二、常用缓冲液和贮存液的配制502

三、常用酸碱的技术参数504

四、细胞染色技术505

五、免疫学研究中常用的鼠系507