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第一部分 生物化学实验技术1

第一章 分光光度技术1

第一节 基本原理1

一、光的基本知识1

二、朗伯-比尔（Lamber-Beer）定律2

第二节 分光光度计结构简介3

一、光源3

二、分光系统（单色器）4

三、狭缝4

四、比色杯4

五、检测器系统4

第三节 分光光度技术的应用5

一、测定溶液中物质的含量5

二、用紫外光谱鉴定化合物5

第四节 分光光度法的误差6

第五节 常见国产分光光度计的使用6

一、72型分光光度计6

二、721型分光光度计7

三、751型分光光度计8

四、使用分光光度计的注意事项10

参考文献10

思考题10

第二章 色谱技术11

第一节 概述11

一、引言11

二、层析过程12

三、层析法分类12

四、各类色谱法简介14

第二节 凝胶色谱14

一、基本理论15

二、凝胶的种类及性质16

三、实验技术17

第三节 离子交换色谱18

一、基本理论18

二、离子交换的分类及常见种类19

三、实验操作20

第四节 亲和色谱21

一、基本理论21

二、实验方法23

第五节 高压液相色谱23

一、分类23

二、易出现的问题25

三、主要设备及操作流程26

第六节 气相色谱27

一、气相色谱法的分类及发展27

二、气相色谱仪的构成及一般流程27

三、气相色谱中层析柱及固定相的特点28

参考文献29

思考题29

第三章 电泳30

第一节 基本理论31

第二节 醋酸纤维素薄膜电泳33

第三节 琼脂糖凝胶电泳33

第四节 聚丙烯酰胺凝胶电泳34

第五节 电泳后大分子的检测38

第六节 等电聚焦40

一、基本原理41

二、载体两性电解质41

三、密度梯度等电点聚焦42

参考文献43

思考题43

第四章 放射性同位素技术44

第一节 概述44

一、放射性同位素的特点44

二、放射性强度及其度量单位44

三、射线与物质的相互作用45

第二节 放射性同位素的应用——同位素示踪法46

一、同位素示踪法基本原理和特点46

二、示踪实验的设计原则47

三、同位素示踪法在生物化学和分子生物学中的应用57

第三节 放射性测量63

一、闪烁型探测器64

二、晶体闪烁计数65

三、液体闪烁计数68

四、放射测量的注意事项77

第四节 放射防护78

一、放射性的危害及防护的必要性78

二、放射防护的三原则79

三、我国现行的放射卫生防护标准80

四、内照射和外照射的防护81

五、放射性污染的清除87

六、合理处理放射性三废90

参考文献91

思考题92

第五章 生物大分子制备基本技术93

第一节 选择材料及预处理93

第二节 细胞的破碎及细胞器的分离93

一、细胞的破碎93

二、细胞器的分离94

第三节 提取和纯化95

一、蛋白质（包括酶）的提取95

二、蛋白质的分离纯化96

三、核酸的提取与纯化97

第四节 浓缩、干燥及保存98

一、样品的浓缩98

二、干燥99

三、贮存100

参考文献100

思考题100

第六章 超离心技术101

第一节 基本原理101

一、相对离心力101

二、沉降速度102

三、沉降系数103

四、沉降时间105

第二节 转头和离心管105

一、固定角度转头105

二、甩开吊筒式转头106

三、垂直管转头106

四、区带转头106

五、离心管107

第三节 离心方法107

一、差速沉淀离心108

二、速度区带离心109

三、等密度离心113

第四节 仪器装置和操作114

一、离心机的类型和应用范围114

二、超速离心机114

三、高速离心机117

四、台式医用离心机117

参考文献118

思考题118

第二部分 基因分子生物学基本技术123

第七章 核酸杂交技术123

第一节 DNA的变性与复性123

一、DNA变性123

二、复性125

第二节 核酸杂交技术概述126

一、前言126

二、探针-靶反应128

第三节 核酸探针128

一、核酸探针的种类129

二、核酸探针的标记和检测132

第四节 核酸分子杂交方法137

一、核酸分子杂交的类型137

二、核酸分子杂交实验因素的优化145

参考文献149

思考题150

第八章 重组DNA技术151

第一节 分子克隆常用技术151

一、核酸的纯化151

二、核酸的浓缩151

三、DNA、RNA的定量152

四、核酸的凝胶电泳和分子量参照物152

第二节 分子克隆常用载体154

一、质粒154

二、单链丝状噬菌体和噬粒156

第三节 分子克隆中常用的酶157

一、限制性内切核酸酶157

二、DNA聚合酶162

三、连接酶163

四、T4噬菌体多核苷酸激酶164

五、碱性磷酸酶164

第四节 DNA的限制酶切割及限制片段的回收164

一、限制酶消化反应的进行164

二、消化产物的凝胶电泳分析165

三、凝胶中DNA片段的回收165

第五节 DNA的连接166

第六节 外源DNA导入宿主细胞169

一、大肠杆菌感受态细胞的制备和转化169

二、高压电穿孔法转化大肠杆菌170

第七节 含重组质粒的细菌菌落的鉴定170

一、插入失活170

二、α互补172

三、小规模制备质粒DNA进行限制酶切分析173

四、杂交筛选174

五、DNA序列分析175

参考文献175

思考题175

第九章 聚合酶链反应（PCR）176

第一节 PCR的基本原理和方法176

一、PCR原理176

二、用于PCR的DNA聚合酶177

三、PCR方法179

四、PCR样品的快速制备179

第二节 PCR技术的应用183

一、在基因工程中的应用183

二、在医学中的应用187

第三节 PCR的设计197

一、标准反应197

二、PCR缓冲液197

三、循环参数198

四、引物的设计199

五、PCR的灵敏度和特异性200

六、PCR污染和残余物201

七、PCR的错误掺入201

参考文献202

思考题202

第十章 DNA序列测定技术203

第一节 序列测定的技术和策略203

一、Sanger双脱氧链终止法203

二、Maxam-Gilbert DNA化学降解法207

三、测序策略209

第二节 Sanger双脱氧链终止法测序210

一、设立双脱氧测序反应210

二、变性聚丙烯酰胺凝胶211

三、应用大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段的双脱氧测序反应219

四、应用测序酶的双脱氧测序反应221

五、测定变性双链DNA模板的序列224

六、测定DNA扩增产物的序列224

第三节 双脱氧测序中出现的问题226

一、模板特异的问题227

二、全局性问题229

三、聚丙烯酰胺凝胶出现的问题229

参考文献229

思考题230

第三部分 生物化学和分子生物学实验233

实验一 蛋白质的变性、凝固及沉淀反应233

实验二 蛋白质等电点的测定236

实验三 几种因素对唾液淀粉酶的作用237

实验四 乳酸脱氢酶（LDH）同工酶的分离239

实验五 脲酶Km值简易测定法241

实验六 血清白蛋白、γ-球蛋白的分离和提纯243

实验七 血清蛋白质醋酸纤维素薄膜电泳248

实验八 Lowry's法测定蛋白质含量251

实验九 紫外吸收法测定蛋白质含量252

实验十 各种血红蛋白吸收光谱的观察253

实验十一 组织DNA与RNA的分离、提纯255

实验十二 DNA与RNA的定量测定257

实验十三 DNA的琼脂糖凝胶电泳259

实验十四 RNA的聚丙烯酰胺凝胶电泳260

实验十五 RNA的合成及其抑制261

实验十六 NK细胞活性的示踪—125I-UdR同位素释放试验264

实验十七 放射性焦磷酸（32ppi）-腺三磷交换法测定核糖核酸连接酶的活性266

实验十八 蛋清溶菌酶的分离268

实验十九 肾碱性磷酸酶的分离270

实验二十 聚丙烯酰胺凝胶电泳272

实验二十一 胰凝乳蛋白酶的制备及活力测定275

实验二十二 用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量280

实验二十三 煮沸法快速提取质粒DNA284

实验二十四 碱裂解法快速提取细菌质粒DNA286

实验二十五 琼脂糖凝胶电泳检查DNA288

实验二十六 DNA体外重组实验290

实验二十七 核酸分子杂交实验293

第四部分 附录299

Ⅰ 生物化学实验须知299

一、实验室规则299

二、实验室急救299

三、玻璃仪器的洗涤及洗液的配制300

四、生化实验样品的制备301

五、实验误差与数据处理304

Ⅱ 试剂的配制307

一、溶液浓度的表示与计算307

二、常用缓冲液配方309

三、指示剂316

四、冷却剂和干燥剂318

五、试剂配制中常用数据319

六、闪烁液配方326

Ⅲ 分子克隆中使用的试剂与缓冲液的配制328

一、酸和碱的浓度328

二、贮存液330

三、杂交试验中用于降低背景的封闭剂335

四、酶类336

五、常用缓冲液336

Ⅳ 分子克隆中的常用技术343

一、玻璃制品和塑料制品343

二、核酸的纯化343

三、DNA和RNA的定量345

四、溴化乙淀溶液的净化处理345

五、核酸的浓缩346

六、核酸中放射性的测定349

七、用于凝胶电泳的标准参照物351

八、放射自显影351

九、凝胶过滤层析352

十、离心柱层析353

十一、透析管的处理355

十二、质粒DNA的纯化355

生物化学和分子生物学实验常用数据资料357

一、层析法常用数据357

二、硫酸铵饱和度的常见表367

三、离心机转数与离心力的列线表369

四、纯化的人血浆蛋白质的分子参数371

五、常用参考蛋白质分子量377

六、透光度和吸光度换算表378

七、同位素资料381

八、元素周期表382

九、DNA资料383

十、字母与词头384

十一、元素表386

十二、常用药品中英文对照及分子式分子量表391