《植物分子生物学及生物技术的实用方法》求取 ⇩

中译本序1

译者的话1

前言1

第一章利用重组DNA技术对植物进行遗传修饰1

第一节引言1

第二节植物遗传转化1

一、DNA转移方法1

目 录1

第三节转基因植物获得的性状3

一、抗昆虫性3

二、转化植物的种类3

二、抗病毒性4

三、抗除草剂4

四、抗逆性5

五、种子储存蛋白的改良6

六、果实成熟期的改变7

七、改变花卉及观赏植物7

八、细胞质雄性不育及自交不亲和7

第四节未来的发展方向8

参考文献8

第二节突变体的类型12

第一节引言12

第二章以拟南芥菜为例产生和分析植物突变体12

第三节诱变14

一、诱变剂的选择15

二、诱变剂量16

三、样板程序17

四、M1代种子库的利用：独立性和不育或致死突变17

第四节突变体筛选和选择21

一、生化突变体21

二、发育突变体22

一、单一座位上的复等位基因23

第五节二次诱变23

二、回复突变子和抑制子24

第六节突变体分析24

一、多次回交24

二、遗传作图25

三、剂量分析25

四、嵌合性和细胞自主性25

五、多基因座位和上位性26

第七节结论28

参考文献28

一、DNA提取30

第二节基因组DNA序列组成的测定30

第三章DNA序列组成及基因拷贝数的测定30

第一节引言30

二、打断DNA及其分子量大小的检测31

三、DNA复性31

四、数据分析32

五、散置序列模式的检测32

六、重复DNA序列的大小分布32

七、基因组中GC含量的测定33

八、Cot曲线的分光光度法测定33

九、复性DNA样品中双链DNA的测定33

一、多基因家族的测定34

第三节基因组中编码序列和非编码序列拷贝数的确定34

二、基因拷贝数的确定35

三、散置重复DNA序列拷贝数的确定35

参考文献36

第四章植物DNA的提取和鉴定38

第一节引言38

第二节CTAB法分离总DNA39

第三节叶绿体DNA的分离42

一、程序Ⅰ：高盐提取方案42

二、程序Ⅱ：蔗糖梯度方案43

三、程序Ⅲ：氯化铯密度梯度方案43

第四节DNA滤膜杂交分析44

一、DNA转移45

二、与固定在滤膜上的核酸杂交46

三、除去结合的探针重新进行杂交47

参考文献47

第五章植物mRNA的分离和鉴定49

第一节引言49

第二节方法50

一、核糖核酸酶的失活或去除50

二、总RNA的分离51

三、多聚核糖体的分离53

分离带多聚腺苷酸尾的poly（A）＋RNA55

四、从总RNA或多聚核糖体RNA中55

五、Northern Blot杂交58

第三节讨论62

参考文献64

第六章向植物中导入外源基因的方法66

第一节引言66

第二节农杆菌天然基因转移系统66

一、菌株和载体68

二、选择标记和报告基因69

三、农杆菌介导的叶盘转化70

（一）一般的步骤、培养基配制和生长条件70

（二）外植体来源和消毒71

（四）卡那霉素抗性芽的切割和生根74

（三）叶盘的制备及农杆菌的感染74

（五）转化的鉴定和T-DNA拷贝数与结构的分析75

第三节直接基因转移76

一、微弹介导的转化77

（一）无菌颗粒和DNA的准备77

（二）轰击植物组织79

第四节转化的植物79

参考文献82

第七章植物转化载体88

第一节引言88

一、关于植物转化的一般考虑88

一、农杆菌介导的转移89

第二节生物性转化载体89

二、农杆菌载体系统90

（一）共整合载体91

（二）双元载体系统93

第三节物理转化载体94

一、细胞转化94

二、细胞器转化95

第四节选择标记和报告基因97

一、遗传选择标记97

二、生化标记98

（一）组成型启动子99

第五节影响基因表达的序列99

一、5′调控序列99

（二）诱导型启动子100

（三）组织特异性／发育调控的启动子101

二、其他5′调控序列102

三、3′调控序列102

（一）转录终止序列102

四、内含子／外显子的影响103

五、影响基因最佳表达的其他因素103

六、亚细胞定位序列103

二、改进的直接吸收转化策略104

一、生物转化104

第六节新方法104

参考文献105

第八章λ克隆文库的构建118

第一节引言118

第二节λ载体119

一、λ置换型载体和基因组DNA的克隆119

二、cDNA克隆及其载体125

第三节利用λ载体构建基因组文库126

一、用于克隆的植物基因组DNA的纯化126

二、部分消化及分离合适大小的DNA片段128

三、λ载体臂和筛选基因组片段的连接130

第四节植物cDNA的制备132

一、cDNA的合成132

二、接头的连接反应及cDNA和λ载体臂的连接反应134

第五节重组λ分子的体外包装135

第六节λ克隆文库的筛选136

第七节λ克隆文库的扩增和储存140

参考文献141

第九章基因在植物细胞中的瞬时表达分析144

第一节引言144

第二节原生质体制备144

二、原生质体计数和活力测定145

一、烟草叶片原生质体的分离145

第三节DNA转染146

一、PEG法146

二、电击法147

第四节报告基因的测定149

一、GUS测定149

参考文献150

第十章植物转录启动子、增强子及终止子的分离和鉴定技术152

第一节引言152

第二节调控区的分离153

一、用cDNA克隆方法分离调控区153

第三节启动子和增强子元件的鉴定154

二、从基因组克隆中分离调控区154

三、示踪法分离启动子区154

一、缺失分析155

二、寡聚核苷酸介导的突变156

三、结合因子157

第四节终止子元件的特征159

第五节报告基因159

第六节瞬间表达分析160

第七节稳定转化的分析160

参考文献161

第一节引言163

第十一章应爪蟾卵母细胞检测植物基因表达163

第二节爪蟾卵母细胞显微注射系统的建立165

一、爪蟾卵母细胞的生物165

二、爪蟾的饲养166

三、卵母细胞的分离166

四、显微注射的设备168

第三节RNA显微注射168

一、背景168

二、RNA的制备169

三、RNA显微注射方法169

四、卵母细胞的放射性标记169

二、DNA显微注射方法170

一、背景170

五、可溶性蛋白提取物的制备170

第四节DNA显微注射170

三、卵母细胞RNA的分离171

第五节爪蟾卵母细胞在植物基因表达研究方面的其他应用172

参考文献173

第十二章植物组织中特异性mRNA的原位定位175

第一节引言175

第二节实验中需考虑的事项175

三、杂交176

（一）探针类型176

二、载玻片的预处理176

一、组织制备176

（二）标记的选择179

（三）杂交条件179

（四）漂洗条件180

四、杂交的检测180

第三节组织制备的实验方法180

一、所需设备和溶液180

二、植物材料的固定181

三、脱水182

四、渗透182

五、包埋182

七、注意事项183

六、切片183

第四节用35S标记的RNA探针杂交的实验方法184

一、前言184

二、RNA探针的制备184

（一）所需设备和溶液184

（二）线性化185

（三）硫标记的转录物的制备186

（四）过柱纯化186

（五）RNA转录物的水解187

三、用35S标记的RNA探针探测组织切片188

（一）所需设备和溶液188

（二）载玻片的预处理189

（三）组织切片的杂交190

四、显微镜载玻片的放射自显影192

（一）所需设备和溶液192

（二）包被载玻片193

（三）乳胶显影193

五、放射自显影的载玻片的染色193

（一）所需设备和溶液193

（二）染色193

（三）用GeniusTMRNA－标记试剂盒制备地高辛标记的探针194

（二）DNA模板的线性化194

（一）所需设备和溶液194

一、探针的制备194

第五节用地高辛标记的探针的杂交实验方法194

二、杂交195

（一）所需设备和溶液195

（二）载玻片的制备195

（三）预杂交195

（四）杂交195

（五）漂洗195

三、用GeniusTM核酸检测试剂盒进行免疫反应195

（一）所需设备和溶液195

（二）方法196

第六节附录197

一、多聚－l－赖氨酸包被的载玻片的制备197

二、DEPC处理玻璃和塑料器皿197

三、溶液197

（一）一般溶液197

（二）放射性杂交所用的溶液198

（三）非放射性杂交所需溶液199

参考文献200

第十三章植物中蛋白质表达的免疫学检测方法203

第一节引言203

一、蛋白质的纯化204

第二节抗体的产生204

二、免疫205

三、采血、血清制备和储存206

四、抗体纯化207

五、多克隆和单克隆抗体207

第三节Western印迹208

一、Western印迹概述208

二、电转移209

三、封闭曝露的位点210

四、第一抗体结合210

五、用酶联第二抗体进行检测210

（一）电转膜211

六、抗体标记的检测及底物的加入211

七、常规方法的一些改进211

（二）缓冲液212

（三）检测系统212

（四）分子量的确定212

（五）封闭溶液213

（六）半干电转移213

第四节免疫分析及筛选实验214

一、概述214

二、酶联免疫吸附实验214

（二）双抗体三明治及抗体捕获215

（一）竞争性抗原捕获215

（三）抗体捕获及间接测定216

三、斑点印迹和狭线印迹216

参考文献217

第十四章植物蛋白的原位免疫细胞化学定位220

第一节引言220

第二节植物蛋白的免疫细胞化学标记：原则、一般技术和局限性221

一、植物细胞蛋白免疫细胞化学的原则221

二、组织处理222

（一）标准的固定方法222

三、抗体探针的制备及检测223

（三）包埋方法223

（二）微波固定法223

四、后包埋标记技术224

（一）胶体金224

（二）金标记蛋白A224

（三）金标记的二级抗体225

（四）标记方法225

五、用于蛋白原位定位的其他抗体方法225

第三节植物组织中特异性蛋白的免疫细胞化学定位226

一、小麦胚溶菌酶的原位定位226

二、受镰刀菌感染的番茄根组织中蔗糖酶的原位定位226

（一）几丁质酶和β-1,3－葡萄糖苷酶的金标记免疫定位227

三、病原相关蛋白的原位定位227

（二）PR-1蛋白的免疫金定位229

四、不同植物组织中富含羟脯氨酸的糖蛋白的原位定位230

五、植物组织中其他蛋白的原位定位231

第四节结论和展望233

参考文献233

第十五章分子生物学计算机软件的获取237

第一节准备237

第二节通过电子函件获取软件238

第三节通过匿名FTP获取软件240

第四节通过“蜗牛”邮寄获取软件241

第五节求助于ARCHIE242

第六节保持消息灵通243

第十六章序列相似性查找、多重序列对比和分子树构建245

第一节引言245

第二节序列相似性查找245

第三节多重序列对比253

第四节分子树构建过程257

一、使用多重序列对比进行距离矩阵分子树构建257

二、同时对比和构建系统发育树258

三、吝啬法构建分子树258

第五节注意事项259

参考文献260

第十七章植物DNA作图261

第一节引言261

一、基于RFLP的DNA作图261

二、基于PCR的DNA作图261

第二节程序262

一、基于RFLP的DNA作图262

（一）探针制备262

（二）用于RFLP分析的植物DNA制备264

（三）RFLP分析267

二、基于PCR的DNA作图269

（一）亲本和分离群体的DNA提取269

（二）PCR-RAPD反应272

（三）电泳分析扩增产物及筛选有用引物274

（四）分离分析和遗传作图274

第三节结论274

参考文献274

第十八章随机扩增多态性DNA（RAPD）分析277

第一节引言277

第二节聚合酶链式反应标记278

一、扩增序列多态性（ASPs）278

二、半随机引物278

三、随机引物278

一、DNA提取280

第三节RAPD方法学280

二、扩增方法281

三、凝胶电泳分离扩增产物284

第四节RAPD分析287

一、DNA分群287

二、连锁288

三、一致性／相关性分析289

参考文献289

十九章植物病原检测与鉴定292

第一节引言292

第二节病毒292

二、用组织印迹杂交分析方法检测植物病毒295

一、用组织印迹免疫分析方法检测植物病毒295

三、用单管PCR扩增程序检测植物病毒或类病毒296

第三节真菌296

一、用DNA探针检测被感染植物组织中的真菌298

第四节细菌299

一、用DNA探针检测植物病斑中的细菌301

第五节软体纲病原菌302

一、用DNA探针检测被感染植物中的MLOs304

二、用DNA探针检测被感染昆虫中的MLOs304

参考文献305