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第一部分分子生物学基本技术3

1 基因组DNA的分离，Southern印迹和杂交3

1.1 基因组总DNA的分离3

1.1.1 导论3

目 录3

1.1 2 提取程序的原理4

1.1.3 CTAB法分离总基因组DNA4

1.1.4 CTAB法微量分离DNA6

1.1.5 Dellaporta,Wood和Hicks（1983）法分离总基因组DNA7

1.1.6 从分离的细胞核中提取DNA9

1.1.7 氯化铯密度梯度离心法纯化DNA10

1.1.8 DNA浓度、纯度和质量的估测11

参考文献11

1.2.2 分离总基因组DNA13

1.2.3 基因组DNA的限制性内切酶酶解和微型凝胶电泳检测13

1.2 Southern印迹13

1.2.1 导论13

1.2.4 DNA的琼脂糖凝胶电泳及向尼龙膜的转移16

参考文献20

1.3 使用放射性标记的探针进行杂交21

1.3.1 导论21

1.3.2 标记探针22

1.3.3 纯化探针24

1.3.4 杂交程序26

1.3.5 膜的探针剥离（filter stripping）30

参考文献31

1.4.1 导论32

1.4.2 提取总的基因组DNA32

1.4 Southern印迹的非同位素检测方法32

1.4.3 DNA的限制性内切酶酶解和Southern印迹33

1.4.4 PCR－地高辛法标记探针33

1.4.5 杂交、洗膜和显影以及探针的去除37

参考文献40

2 基因组DNA的克隆及文库构建43

2.1 PCR技术在植物分子生物学中的应用43

2.1.1 导论43

2.1.2 DNA扩增程序46

2.1.3 PCR优化48

2.1.4 克隆49

2.1.5 PCR技术在克隆以外的其他方面的应用53

参考文献57

2.2.1 导论60

2.2 质粒文库60

2.2.2 分离DNA61

2.2.3 基因组DNA和质粒的限制性内切酶酶解61

2.2.4 连接入质粒载体63

2.2.5 感受细胞的制备64

2.2.6 转化方法66

2.2.7 菌落分析68

2.2.8 文库／质粒的保存72

参考文献72

2.3 λ基因组克隆（Lambda genomic cloning）75

2.3.1 导论75

2.3.2 使用置换型载体λ2001构建λ基因组文库的操作方法78

2.3.3 λ2001文库的滴度测定86

2.3.4 λ2001基因组文库的扩增86

2.3.5 文库铺板进行扩增或杂交筛选87

2.3.6 制备噬菌斑杂交用膜87

2.3.7 阳性噬菌体的分离和高滴度贮存液的构建88

2.3.8 杂交阳性噬菌体的DNA制备89

参考文献91

2.4 粘粒文库92

2.4.1 导论92

2.4.2 克隆策略92

2.4.3 文库的构建94

2.4.4 有关粘粒文库筛选和重组粘粒克隆分析的建议99

参考文献100

2.5 酵母人工染色体（YAC）文库102

2.5.1 导论102

2.5.2 植物中百万碱基级大片段DNA的制备104

2.5.3 载体的制备108

2.5.4 对基因组DNA进行EcoRI部分酶解以及通过109

PFGE对EcoRI片段进行大小选择109

2.5.5 连接和转化样品的制备110

2.5.6 酵母原生质体转化111

2.5.7 酵母人工染色体克隆的制备和PFGE分析113

2.5.8 YAC文库的保存和筛选114

参考文献115

3RNA的提取、克隆和减法杂交119

3.1 从植物细胞中分离和分析信使RNA以及cDNA的克隆119

3.1.1 导论119

3.1.2 RNA的分离122

3.1.3 mRNA的纯化126

3.1.4 RNA的分析128

3.1.5 失控转录132

3.1.6 特定mRNA的5′和3′端的作图136

3.1.7 cDNA的合成138

3.1.8 特异mRNA的定量（定量RT-PCR）140

3.1.9 cDNA的克隆143

差异显示逆转酶－聚合酶链式反应（DDRT-PCR）148

3.1.10 一种克隆差异表达的cDNA的新方法：148

参考文献153

3.2 不同mRNA的减法杂交157

3.2.1 引言157

3.2.2 RNA的制备158

3.2.3 加尾的第一链cDNA的合成158

3.2.4 代表性cDNA库的扩增160

3.2.5 杂交162

3.2.6 减法163

3.2.7 再扩增164

3.2.8 进一步杂交／减法循环164

3.2.9 相减后的cDNA分析164

3.2.10 克隆构建减法文库169

参考文献171

3.2.11 结论171

4 克隆的鉴定174

4.1 DNA测序174

4.1.1 引言174

4.1.2 嵌套不定向缺失产物的生成178

4.1.3 质粒DNA的测序185

参考文献198

4.2 克隆基因的表达200

4.2.1 导论200

4.2.2 载体构建和蛋白表达201

4.2.3 蛋白纯化203

4.2.4 Westem印迹208

参考文献211

5 细胞器DNA的分离217

5.1 导论217

第二部分植物DNA的鉴定217

5.2 叶绿体和线粒体DNA的分离222

5.2.1 叶绿体DNA的分离222

5.2.2 线粒体DNA的分离225

参考文献229

6 RAPD分析：基因组的鉴定、特征标记及作图236

6.1 导论236

6.2 遗传指纹作图237

6.2.1 方法238

6.2.2 遗传关系分析242

6.3 遗传连锁图谱的建立244

6.3.1 总体作图策略244

6.3.2 有目标的方法245

6.4 应用前景251

参考文献252

7 植物核基因组RFLP作图：259

实验设计，连锁图的建立和QTL作图259

7.1 导论259

7.2 实验设计261

7.2.1 纯合性与杂合性亲本261

7.2.2 选择一个分离群体262

7.3 RFLP探针的产生与选择265

7.3.1 cDNA探针265

7.3.2 基因组DNA探针265

7.3.3 从其他作图群体中获得探针265

7.4 RELP分析的实验室程序266

7.5 连锁图谱的构建266

7.5.1 单位点分离分析267

7.5.2 检测位点间的连锁269

7.5.3 重组频率和图距的估测274

7.5.4 组建连锁群276

7.5.5 位点排序276

7.5.6 图谱构建时对偏离一般假设的敏感性278

7.6 数量性状位点作图280

7.6.1 标记组的方差分析281

7.6.2 区间作图法285

7.6.3 多个QTL方法290

7.6.4 上位性291

7.6.5 多效性作用292

7.7 总结292

参考文献293

第三部分基因工程——方法和分析305

8 植物基因转化305

8.1 导论305

8.2 农杆菌介导的基因转化307

8.2.1 通过根瘤农杆菌转化烟草308

8.2.2 通过根瘤农杆菌转化番茄310

8.3 直接基因转化312

8.3.1 水稻原生质体的直接基因转化312

8.3.2 基因枪法316

8.4 原生质体融合319

8.4.1 化学融合320

8.4.2 电融合321

参考文献323

9 转基因植物的分子生物学鉴定326

9.1 导论326

9.2 选择性标记基因326

9.3 转化体的分子鉴定329

9.3.1 对Southern分析的结果进行解释329

9.4.1 gusA（β－葡糖醛酸糖苷酶基因）用作报告基因330

9.4 报告基因的表达分析330

9.4.2 GUS活性的组织化学定位332

9.4.3 luc（萤火虫萤光素酶基因）作为报告基因334

参考文献336

10 体细胞杂种的分子鉴定338

10.1 导论338

10.2 体细胞杂种的一般性鉴定339

10.3 体细胞杂种的分子鉴定339

10.3.1 核基因组339

10.3.2 细胞器基因组345

参考文献347

11 转基因植物的细胞学鉴定：353

荧光原位杂交（FISH）定位低拷贝及重复的DNA序列353

11.1 导论353

11.2.3 探针类型354

11.2.4 标记物的选择354

11.2.1 染色体制备354

11.2.2 高分裂中期指数354

11.2 ISH检测低拷贝序列操作程序的优化354

11.2.5 标记方法的选择355

11.2.6 检测系统的选择355

11.2.7 低拷贝信号的成像356

11.2.8 多重标记和再杂交356

11.3 显示荧光ISH信号356

11.4 染色体制备357

11.5 探针制备357

11.5.1 从凝胶中提纯DNA357

11.5.2 切口平移法标记DNA357

11.6 原位杂交的操作程序358

参考文献368

12.1 导论371

12 体细胞杂种的细胞学特性：371

用基因组原位杂交（GISH）检测基因组来源371

12.2 优化GISH条件用以区分基因组372

12.2.1 标记方法的选择372

12.2.2 总DNA作为探针进行原位杂交372

12.2.3 探针的穿透性／目标的可接近性372

12.2.4 严紧度373

12.2.5 封闭DNA373

12.2.6 检测系统的选择373

12.2.7 观察和记录结果374

12.3 细胞制备物374

12.3.1 预处理和固定（要点1,2和7）376

12.3.2 根尖压片制备染色体样品377

12.3.3 酶解制备染色体样品（要点5）377

12.3.4 减数分裂染色体的制备（要点6～8）378

12.4 探针制备379

12.4.1 总DNA的分离381

12.4.2 用切口平移法进行总DNA的生物素标记（要点3,4）381

12.4.3 用点杂交检查生物素的掺入382

12.5 基因组原位杂交383

12.6 显微镜技术和照相技术386

参考文献387

11和12 的补充具小、染色体的植物种的原位杂交391

A.1 导论391

A.2 用蚜栖菌素（Aphidicolin）处理获取前中期染色体392

A.2.1 蚜栖菌素处理番茄根尖细胞同步化393

A.2.2 染色体压片394

A.3 原位杂交395

参考文献395

附录重要植物种的核基因组大小398