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第一章 大肠杆菌的应用1

一、菌株1

(一)菌株的纯化1

(二)菌株的来源1

(三)常用的菌株2

(四)谱系和遗传图2

(五)菌株的生理测量2

(六)菌株的保存3

二、细菌的培养3

(一)细菌的特性3

(二)噬菌体的污染5

(三)用作生理测量的菌株6

(四)用作遗传学研究的菌株7

(五)培养用于提纯某些分子的细菌9

三、细胞密度的测量9

四、细菌的大量培养11

五、细胞的破碎15

(一)超声波法16

(二)氧化铝磨碎法16

(三)玻璃珠磨碎法16

(四)用溶菌酶破碎细胞17

七、亚硝基胍的诱变作用18

六、细菌的放射性标记18

八、青霉素的选择作用19

九、消除菌体中的 F-因子20

(一)用吖啶橙消除 F-因子21

(二)选择自发地消除 F-因子的菌株21

(三)用十二烷基磺酸钠去除 F-因子21

(四)用高温消除 F-因子21

十、培育抗链霉素的菌株22

十一、recA 和细菌的杂交22

十二、P1噬菌体转导的遗传标记23

十三、大量的遗传杂交26

十四、利用转位子建立新的菌株28

第二章 λ噬菌休29

一、两株有用的突变株29

(一)CI~(857)29

(二)S~730

二、测定效价30

三、平板原液的制备31

四、大规模液体培养34

五、提纯36

六、遗传杂交38

七、噬菌斑记数39

八、筛选λ抗性突变株40

九、测试菌落生长λ噬菌体的能力41

十、构建溶原性细菌42

十一、测试可能的溶原性细菌44

十二、划线分离单噬菌斑44

十三、选择缺失45

第三章 酶的测定47

一、β-半乳糖苷酶47

二、RNA聚合酶49

三、阿拉伯糖异构酶51

四、溶菌酶55

五、核酮糖激酶57

六、大肠杆菌-偶联转录-翻译系统62

第四章 蛋白质的实验68

一、蛋白质的硫酸铵沉淀69

二、利用相分配法去除核酸71

(一)从核酸中分离大量蛋白质72

(二)结合DNA或RNA的蛋白质的纯化74

三、柱、分部收集器及其管道75

四、离子交换层析和凝胶过滤76

(一)离子交换树脂的制备76

(二)装柱77

(三)加样和洗脱78

五、蛋白质浓度的测定81

(一)光密度法81

(二)双缩脲法82

(三)Lowry法82

(二)带有浓缩胶的SDS-10％丙烯酰胺凝胶83

(四)Lowry法测定稀释的样品83

六、浓缩蛋白质溶液84

七、稳定蛋白质85

八、蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳86

(一)制备夹层凝胶87

(三)尿素-SDS-丙烯酰胺梯度凝胶93

(四)凝胶的染色95

(五)[~3H]或[~(35)S]-标记的蛋白质在丙烯酰胺凝胶中的荧光图谱96

(六)从DMSO溶液中回收PPO97

第五章 核酸的实验98

一、核酸的浓度和纯度测定98

(一)光学方法98

(二)荧光方法99

二、DNA 的储备101

三、DNA 的提纯102

四、用乙醇沉淀DNA105

五、TCA 沉淀测定106

(一)用DEAE纯化DNA108

八、λDNA 的分离109

(一)苯酚抽提110

九、质粒DNA的分离111

(二)SDS抽提111

十、大量分离质粒117

十一、果蝇DNA的分离120

十二、三磷酸核苷溶液的制备123

十三、核苷的层析分析124

十四、DNA的凝胶电泳125

(一)琼脂糖凝胶电泳127

(二)聚丙烯酰胺凝胶电泳132

(三)凝胶的染色和照相134

(四)从丙烯酰胺和琼脂糖凝胶中提取DNA135

十五、限制性核酸内切酶酶切DNA的位点图谱138

一、DNA 分子末端的连接142

第六章 重组体DNA的构成与分析142

(一)以S1酶消化制作钝性末端143

(二)用T_4 DNA连接酶连接143

(三)λ核酸外切酶消化产生游离3＇末端145

(四)加入同聚物末尾146

二、用质粒DNA使大肠杆菌转化147

三、贮存含有质粒的菌株149

四、重组体质粒的环丝氨酸选择150

五、DNA和RNA的体外放射性同位素标记151

(一)用缺口翻译放射标记DNA151

(二)合成与DNA互补的放射标记的RNA153

(三)合成与RNA互补的放射标记的DNA155

(四)放射标记RNA或DNA的5＇末端157

六、核酸杂交反应的一般性质159

七、以核酸杂交筛选重组体DNA克隆160

(一)筛选噬菌体空斑161

(二)筛选菌落164

八、从单个菌落中分离DNA165

九、Southern 转移166

十、选择与DNA互补的RNA171

(一)制备 DNA172

(二)制备 NBM纸172

(三)使NBM纸转变成DBM纸以及结合DNA172

(四)RNA与结合DBM的DNA杂交173

(五)回收RNA173

(六)NBPC(nitrobenzylpyridinikim chloride)的合成174

十一、某些高级生物的体外翻译系统176

(一)制备麦胚提取液176

(二)麦胚翻译反应178

(三)制备兔网织细胞溶解物179

(四)细胞溶解物的微球菌核酸酶消化180

(五)网织细胞翻译反应180

十二、纯化总的和多核糖体 RNA181

(一)从果蝇成虫中提纯 RNA182

(二)从果蝇胚胎中提纯多核糖体RNA183

十三、POLY-A~+(富含mRNA的)RNA的纯化184

(一)制作蔗糖梯度187

十四、用蔗糖梯度离心对RNA大小进行分级187

(二)制备 RNA188

(三)沉淀和收集 RNA188

一、玻璃和塑料容器189

第七章 辅助性实验室技术189

二、玻璃器皿的硅化190

三、吸管的洗涤190

四、pH 计191

五、缓冲液193

(一)Tris193

(二)磷酸193

六、Beckman超速离心机194

(一)离心管的充盈和平衡194

(四)二甲砷酸盐194

(二)用羟基磷灰石柱纯化DNA194

(三)Good 氏缓冲液194

(二)装转头195

七、绘图196

六、DNA 的聚乙二醇沉淀和大小分段197

八、幻灯片和负片197

(一)Polaroid幻灯片197

七、大肠杆菌DNA的分离198

(二)常规幻灯片和负片198

九、胶片感光性199

十一、透析袋202

十二、酚的蒸馏204

十三、回收用过的CsCl205

十四、化学试剂的来源206

十五、危害和警告207

(一)干燥器、制备性离心机和真空泵207

(二)化学试剂207

(三)电的危害和防护209

附录Ⅰ 常用试剂制备212

附录Ⅱ 常用数据222

参考文献224

十、放射自显影和荧光照相290