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第一章 研究用显微镜技术1

1.1 研究用显微镜的结构原理1

1.2 研究用显微镜的光学系统2

1.2.1 显微镜的基本光学参数2

1.2.2 光学透镜的象差3

1.2.3 显微镜的光学系统4

1.3 研究用显微镜的各类6

1.3.1 明视场显微镜6

1.3.2 音视场显微镜6

1.3.3 相差显微镜7

1.3.4 微分干涉差显微镜8

1.3.5 偏光显微镜10

1.3.6 荧光显微镜11

1.4 实验12

1.4.1 明视场显微镜的观察方法12

1.4.2 相差显微镜的观察方法13

1.4.3 荧光显微镜的观察方法14

1.4.4 DNA的光学显微镜结构观察14

1.4.5 淀粉粒的偏光显微镜观察15

1.4.6 显微摄影技术16

1.4.7 显微照片的半自动定量分析17

思考题17

参考文献18

第二章 电子显微术19

2.1 透射电子显微镜19

2.1.1 分辨能力和放大倍数19

2.1.2 电子束及其形成21

2.1.3 磁透镜22

2.1.4 图像的反差形成原理26

2.1.5 透射电子显微镜的仪器结构27

2.1.6 透射电子显微镜的使用操作30

2.2 扫描电子显微镜34

2.2.1 电子与样品的相互作用34

2.2.2 扫描电子显微镜的成像原理36

2.2.3 扫描电子显微镜的仪器结构37

2.2.4 扫描电子显微镜的使用操作38

2.3 X射线微区分析39

2.3.1 X射线的产生及其特性40

2.3.2 X射线的检测41

2.3.3 X射线微区分析的工作方法45

2.3.4 X射线微区分析在生物学中的应用46

2.4 扫描隧道显微镜47

2.4.1 工作原理47

2.4.2 在生命科学中的应用47

2.5.3 扫描电镜的应用49

2.5.2 不使用超薄切片的电镜技术49

2.5.1 用透射电镜观察超薄切片49

2.5 电子显微术在生命科学中的应用实例49

思考题50

参考文献50

附录50

第三章 超显微结构制样技术52

3.1 超薄切片技术52

3.1.1 取材53

3.1.2 固定54

3.1.3 漂洗与脱水59

3.1.4 渗透、包埋与聚合60

3.1.5 超薄切片63

3.1.6 超薄切片的染色65

3.2 实验67

3.2.1 Formvar支持膜的制备67

3.2.2 动物样品包埋块的制备68

3.2.3 植物样品包埋块的制备69

3.2.4 超薄切片71

3.2.5 超薄切片的染色73

3.2.6 半薄切片的染色75

3.3 负染色技术77

3.3.1 常用的负染色液77

3.3.3 负染色应注意的问题78

3.3.2 染色方法78

3.4 分子生物学电镜制样技术80

3.4.1 核酸大分子电镜制样技术80

3.4.2 蛋白质大分子电镜制样技术85

3.4.3 多糖大分子电镜制样技术86

3.5 电子显微镜细胞化学技术87

3.5.1 基本原理87

3.5.2 三磷酸腺苷酶(ATPase)88

3.5.3 酸性磷酸酶(ACP)89

3.5.4 碱性磷酸酶(ALP)90

3.5.5 琥珀酸脱氢酶(SDH)91

3.5.6 葡萄糖-6-磷酸酶93

3.5.7 髓过氧化物酶94

3.6 电镜放射自显影技术95

3.6.1 原理95

3.6.2 材料与仪器设备97

3.6.3 实验步骤97

3.7 冷冻复型技术101

3.7.1 原理101

3.7.2 仪器设备及药品102

3.7.3 实验步骤103

3.7.4 冷冻蚀刻复型图像的辨认106

3.8 免疫电镜胶体金标记法107

3.8.1 基本原理107

3.8.2 实验程序108

3.8.3 电镜水平的免疫染色111

3.9 核酸分子杂交技术115

3.9.1 基本原理115

3.9.2 试剂和器具116

3.9.3 rDNA探针的制备和标记116

3.9.4 原位杂交及杂交子的检测118

3.10 扫描电镜样品制备技术119

3.10.1 基本原理119

3.10.2 扫描电镜的活体样品的制备121

3.10.3 孢子、花粉等少水样品的制备121

3.10.4 扫描电镜一般生物样品制备方法--ODO-导电染色法121

参考文献123

思考题123

附录1 仪器操作步骤124

附录2 缓冲液125

附录3 固定液127

附录4 其它129

第四章 超离心技术130

4.1 基本原理130

4.1.1 离心力130

4.1.2 沉降系数131

4.1.3 沉降时间133

4.2.1 高速离心机134

4.1.4 沉降速度134

4.2 离心机的种类和基本结构134

4.2.2 制备性超速离心机135

4.2.3 分析性超速离心机136

4.3 超离心法137

4.3.1 差速离心法137

4.3.2 密度梯度离心法137

4.3.3 等密度梯度离心法139

4.3.4 密度梯度的制备和收集139

4.4.1 分子量的测定142

4.4.2 未知DNA样品密度的测定142

4.4 超速离心在生物学中的应用142

4.4.3 从密度推算DNA的G-C碱基含量143

4.4.4 检测生物大分子中构象的变化143

4.5 实验144

4.5.1 大鼠肝线粒体的分离144

4.5.2 大鼠肝细胞核的分离145

4.5.3 氯化钠密度梯度纯化质粒DNA146

4.5.4 氯化铯等密度梯度超离心纯化质粒DNa147

思考题150

参考文献151

附录1 离心机的操作规程151

附录3 离心机转数(rpm)与相对离心力(RCF)的换算153

第五章 紫外-可见分光光度法155

5.1 基本知识155

5.1.1 紫外-可见光吸收光谱的本质155

5.1.2 Lambert-Beer定律156

5.1.3 吸收定律的正确应用157

附录2 DGF-U型密度梯度形成仪操作规程158

5.2 分光光度计的一般结构160

5.3 紫外-可见分光光度计的特殊装置162

5.3.1 扫描装置的设计原理162

5.3.3 双光束分光光度计的光路设计163

5.3.4 双波长分光光度计的光路设计163

5.3.2 斩波器163

5.4 分光光度法164

5.4.1 定性分析164

5.4.2 定量分析165

5.5 生物大分子的光学特性167

5.5.1 蛋白质的光学特性167

5.5.2 核酸的光学特性168

5.6 实验168

5.6.1 单色器的分光效应168

5.6.2 高锰酸钾的可见光谱169

5.6.3 蛋白质和DNA的紫外吸收光谱170

5.6.4 蛋白质的微分光谱170

5.6.5 苹果酸脱氢酶(MDH)的测定172

5.6.6 不同组织苹果酸脱氢酶km值的测定173

5.6.7 心骨、骨骼肌线粒体内膜ATPase的测定174

5.6.8 DNA的Tm值测定174

5.6.9 DNA中A-T碱基含量的紫外分析法175

5.6.10 烟酸的光谱测定176

5.6.11 豆类球蛋白的定量分析178

5.6.12 豆类醇溶蛋白的定量分析179

5.6.13 维生素D的测定180

5.6.14 豆类种子β-胡萝卜素的测定182

思考题184

参考文献184

6.1.1 分子的主要振动类型--伸展振动和弯曲振动185

第六章 红外分光光度法185

6.1 基本知识185

6.1.2 吸收带的位置和强度186

6.1.3 吸收峰的表示方法187

6.1.4 几种常用术语187

6.2 基本结构187

6.2.1 干涉仪原理188

6.2.2 付里叶转换189

6.3 红外光谱分析的试样制备方法190

6.4 实验191

6.4.1 试样制备技术191

6.4.2 蛋白质的红外光谱分析192

6.4.3 多糖分子的红外光谱分析193

6.4.5 毛纤维的红外光谱分析194

6.4.4 脂溶性维生素的红外光谱分析194

6.4.6 红外光谱法在基因探测中的应用195

思考题196

参考文献196

附录 5DX付里叶转换红外分光光度计197

第七章 荧光分光光度法201

7.1 荧光分析的基本知识201

7.1.1 荧光的产生201

7.1.2 荧光量子产率201

7.1.5 相对荧光量子效率202

7.1.3 荧光强度202

7.1.4 荧光偏振202

7.2 荧光分光光度计的基本结构204

7.3 荧光分析的影响因素及注意事项204

7.3.1 温度对荧光的影响204

7.3.2 pH的影响204

7.3.3 溶剂的影响204

7.3.4 荧光的消退204

7.3.5 防止污染204

7.4 生物样品的荧光分析204

7.4.1 维生素B1的测定206

7.4.2 维生素B2的测定208

7.4.3 维生素C的测定209

7.4.4 维生素E的测定211

7.4.5 微量元素硒的测定213

7.4.6 蛋白质的测定215

7.4.7 肌肉中乳酸脱氢酶的测定216

7.4.8 毫微克DNA的测定217

7.4.9 单个细胞核DNA的测定218

7.4.10 线粒体质膜流动性的测定218

思考题219

参考文献220

附录 RF-540荧光分光光度计的性能和操作方法220

8.1.1 原子吸收光谱的产生221

第八章 原子吸收光谱分析技术221

8.1 基本原理221

8.1.2 原子谱线的轮廓与变宽222

8.1.3 吸收定律224

8.2 仪器结构225

8.2.1 光源226

8.2.2 原子化器226

8.2.3 单色器227

8.2.4 检测器和读出系统227

8.3 分析方法228

8.3.1 原子吸收光谱分析中的干扰及其消除228

8.3.2 分析方法230

8.3.3 灵敏度和检出限232

8.4 实验233

8.4.1 苹果中钙储量的测定233

8.4.2 血清中镁含量的测定234

8.4.3 头发中铅含量的测定235

8.4.4 食用豆中微量元素铁、锰、锌含量的测定236

8.4.5 食用豆中微量元素铜、镍含量的测定237

思考题238

参考文献239

附录1 塞曼原子吸收法的主要吸收线和原子吸收相对灵敏度239

附录2 日立180-80型偏振塞曼原子吸收分光光度计操作规程241

9.1 显得分光光度法测定原理246

第九章 扫描显微分光光度法246

9.2 显微光度计扫描测定的基本原理247

9.3 扫描显微分光光度计的基本结构247

9.3.1 显微镜248

9.3.2 光度计248

9.3.3 扫描系统249

9.3.4 自动控制系统249

9.4 显微光度法的应用实例250

9.4.1 细胞容积的测定250

9.4.2 剧烈运动前后细胞内酶的显微定量分析251

9.4.3 染色体的核型分析253

9.4.4 人染色体脆性位点的测定254

9.4.5 染色体带纹的定量分析256

9.4.6 核DNA的显微荧光定量分析261

9.4.7 鱼三倍体DNA孚尔根测定方法262

9.4.8 染色体DNA的显微荧光定量分析263

9.4.9 毛纤维的荧光测定264

思考题264

参考文献265

附录 Univar扫描显微分光光度计的及操作方法265

第十章 气相色谱技术267

10.1 基本原理267

10.1.1 概述267

10.1.2 气相色谱的分析过程268

10.2 气相色谱仪的基本结构269

10.2.1 气相色谱填充柱269

10.2.2 毛细管色谱柱271

10.2.3 检测器272

10.3 气相色谱分析方法274

10.3.1 操作条件的选择274

10.3.2 定性和定量方法275

10.4 实验277

10.4.1 食用豆类脂肪酸的气相色谱分离和测定277

10.4.2 植物激素脱落酸的毛细管色谱分离和测定279

10.4.3 微生物胞外多糖的毛细管色谱分离和测定281

10.4.4 玉米暝昆虫激素的气相色谱分离和测定282

10.4.5 酒精发酵液乙醇含量的气相色谱分析283

10.4.6 食用豆类磺的测定284

10.4.7 丁醇的气相色谱分析286

10.4.8 植物材料释放乙烯的气相色谱分离和测定288

思考题289

参考文献289

附录1 岛津GC-7A气相色谱仪的操作方法289

附录2 实验室常用固定液293

附录3 不同温度下水的饱和蒸气压294

附录4 不同进出口压力时的压力校正值j294

附录5 标准筛的规格295

第十一章 高效液相色谱分离分析技术296

11.1 概述296

11.2 HPLC的类型及其分离的基本原理296

11.2.1 液-固色谱296

11.2.2 液-液色谱和键合相色谱297

11.2.3 离子交换色谱298

11.2.4 排斥色谱(凝胶色谱)298

11.3 高效液相色谱仪的结构299

11.3.1 储液瓶299

11.3.2 高压输液泵300

11.3.3 进样系统300

11.3.5 检测器301

11.3.4 色谱柱301

11.4 实验302

11.4.1 单核苷酸的分离分析302

11.4.2 可溶性糖的定量分析303

11.4.3 氨基酸的分离分析技术304

思考题306

参考文献307

附录1 岛津LC-4A高效液相色谱仪的结构与操作307

附录2 氨基酸分析的预处理技术310

12.1 仪器结构原理317

12.1.1 测定原理317

第十二章 薄层色谱扫描仪317

12.1.2 仪器结构318

12.2 扫描方法321

12.3 实验322

12.3.1 线性扫描操作技术322

12.3.2 锯齿扫描操作技术322

12.3.3 微量核酸样品的定量分析323

12.3.4 同功酶的定量分析323

思考题324

参考文献325

附录1 CS-910双波长薄层色谱扫描仪的性能与操作325

附录2 C-RIB的定量分析方法327

13.1 基本原理329

第十三章 等电聚焦凝胶电泳技术329

13.2.1 平床电泳仪331

13.2.2 与平床电泳仪配套的装置331

13.2 仪器结构331

13.3 聚丙烯酰胺(PAA)凝胶332

13.3.1 聚丙烯酰胺凝胶的结构和聚合332

13.3.2 聚丙烯酰胺凝胶浓度和交联度333

13.3.3 聚丙烯酰胺凝胶的制备334

13.3.4 凝胶板的制备335

13.3.5 凝胶板的放置335

13.3.6 电泳操作335

13.3.8 加样336

13.3.7 预聚焦336

13.3.9 电泳337

13.3.10 固定与染色337

13.4 实验338

思考题340

参考文献340

附录 多用电泳仪的结构和操作要点340

第十四章 交变脉冲电场凝胶电泳346

14.1 原理346

14.2 交变脉冲电泳装置的类型346

14.2.1 正交交变电场凝胶电泳346

14.2.2 箝形均匀电场电流347

14.2.3 旋转凝胶电泳348

14.2.4 倒转电场凝胶电泳348

14.3 影响PFGE分离的因素348

14.3.1 脉冲时间的影响348

14.3.2 分子大小、电场强度和温度的影响348

14.3.3 电场间角度的影响349

14.4 分子陷阱349

14.5 分子泳动的机制350

14.5.1 常规电泳的分子机制350

14.5.2 FIGE分离过程的分子机制350

14.5.3 分子在OFAGE中的重新定向机制350

14.5.4 巨大分子的泳动351

14.6 带宽和分辨率352

14.7 脉冲电泳方法352

14.7.1 样品制备352

14.7.2 DNA的标准品352

14.7.3 电泳方法353

14.8 应用实例353

14.8.1 酵母染色体OFAGE的分离353

14.8.2 棉病囊霉的电泳核型分析354

14.8.3 小麦、大麦、黑麦大分子量的DNA的脉冲电泳分离355

14.8.4 水稻大分子DNA的脉冲电泳分离355

参考文献356