《表1 EGFP基因引物》

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《人肝脏MST1相关miRNA的筛选、质粒构建与验证》

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对CD810A-1质粒进行改造，添加EGFP绿色荧光标记，以便于后期对转染效率的评估及对表达载体的追踪。设计并合成EGFP基因的引物，以EGFP质粒为模板，利用PrimeSTARR Max DNA Polymerase高保真酶扩增目的基因EGFP全长。使用限制性内切酶Xba I和EcoR I将CD810A-1载体和EGFP目的基因片段分别双酶切，核酸电泳后使用胶回收试剂盒回收纯化目的条带，使用DNA Ligation Kit Ver.2.1快速连接酶在16℃水浴条件下30min，快速连接线性化的载体与目的片段。将连接产物转化至Stbl3感受态细胞，在含氨苄青霉素的LB固体培养基上过夜培养12～16h，挑选合适的单克隆溶于微量无菌ddH2O，以菌水为模板进行PCR快速鉴定。初步鉴定成功的单克隆在含氨苄青霉素的LB液体培养基中过夜培养12～16h，使用质粒小提试剂盒提取质粒，并将重组质粒进行双酶切鉴定，鉴定结果正确的菌落克隆用于测序，测序正确的克隆即为构建成功的CD810A-1-EGFP重组载体，进行无类毒素中提备用。