《表2 hsa-miR-448和hsa-miR-518a-3p基因引物》

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《人肝脏MST1相关miRNA的筛选、质粒构建与验证》

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设计并合成hsa-miR-448和hsa-miR-518a-3p引物，以人基因组DNA为模板，利用PrimeSTARR Max DNA Polymerase高保真酶扩增目的基因hsa-miR-448和hsa-miR-518a-3p全长。使用限制性内切酶BamH I和Sal I将CD810A-1-EGFP载体和目的片段hsa-miR-448和hsa-miR-518a-3p基因分别双酶切，核酸电泳后使用胶回收试剂盒回收纯化目的条带，使用DNA Ligation Kit Ver.2.1快速连接酶在16℃水浴条件下30min，快速连接线性化的载体与目的片段。将连接产物转化至Stbl3感受态细胞，在LB固体培养基上过夜培养12～16h，挑选合适的单克隆溶于微量无菌ddH2O，对其进行快速PCR鉴定。初步鉴定成功的单克隆在LB液体培养基中过夜培养12～16h，使用质粒小提试剂盒提取质粒，并将重组质粒进行双酶切鉴定，鉴定结果正确的菌落克隆用于测序，测序正确的克隆即为构建成功的CD810A-1-EGFP-miR448和CD810A-1-EGFP-miR518a-3p重组质粒，采用无内毒素质粒中提试剂盒提取质粒备用。