《表2 线粒体基因coxⅠ-rrnS引物和α-芋螺毒素前体基因引物》

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《海南产桶形芋螺线粒体基因组DNA提取条件的优化》

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通过NCBI数据库，对已知几种芋螺线粒体全长序列进行同源性比较，发现coxⅠ和rrnS基因区段具有高度的保守性，根据该区段设计PCR的引物（表2），克隆区段包含coxⅠ基因至rrnS基因，长度约4.5 kb。该区段内的基因可作为线粒体标志基因。以mtDNA为模板，扩增该目的片段采用长距离PCR（LA-PCR）反应体系:总体系25μL，Super HiFi Mix 12.5μL，ddH2O 11μL；PCR反应条件如下，预变性:94℃，2 min；循环内:变性94℃，30 s；退火50℃，30 s；延伸68℃，4 min，共30个循环，最后确保延伸72℃，10 min。取6μL PCR产物，跑琼脂糖凝胶电泳检测，胶浓度为1%，电压90 V，电泳时间25 min，观察条带，确定为目的基因后，将含有克隆片段的质粒送往上海生工测序，NCBI数据库比对。同时以桶形芋螺核基因组总DNA为模板，进行coxⅠ-rrnS基因的扩增，看所提核基因组DNA中是否含有mtDNA。