《表1 mi R319前体序列克隆与靶基因5'-RACE引物》

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《桑树中miR319的克隆及在雄花发育中表达分析》

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mi R319的前体序列使用在线网站RNAfold（http://www.tbi.univie.ac.at/～ivo/RNA/ViennaRNA-1.8.1.tar.gz）在川桑基因组中预测，对预测后的结果进行筛选。用Primer Premier 5软件设计引物（表1），参照PrimeSTARHS DNA Polymerase使用说明扩增前体序列。使用在线网站psRNATarget（http://plantgrn.noble.org/ps RNATarget/analysis?function=3）预测桑树mi R319家族在川桑基因组中的靶基因[16]。利用5'-RACE技术进行靶基因验证[17]，在mi R319与预测到的靶基因互补位点下游设计2条5'-RACE下游特异性引物（表1），采用GeneRacer Kit（Invitrogen，美国）在RNA 5'端加上寡核苷酸接头后用Oligo（dT）反转录成cDNA。cDNA稀释10倍后利用试剂盒中通用引物和设计的特异性引物对每个基因进行PCR扩增，扩增产物用快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒[生工生物（上海）有限公司]回收，并连接到pMD18-T（TaKaRa，日本），转化到E.coli DH5a感受态细胞（TaKaRa，日本）中，涂板后37℃过夜培养，挑选单克隆送至上海生工生物有限责任公司测序。