《表1 q-PCR引物序列》

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《不同微结构磷酸三钙材料对Wnt非经典信号通路相关标志物蛋白的表达影响》

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表注：FZD1：卷曲蛋白1、ROR2：神经营养酪氨酸激酶相关受体-2；DKK1:dickkopf相关蛋白1、GAPDH：甘油醛-3-磷酸脱氢酶。

（1） 弃去培养板中的剩余培养基，加入PBS冲洗，按照RNA提取试剂盒操作说明提取获得总RNA；Nanodrop分光光度计测定样品的RNA浓度及纯度并记录相关数值；（2）Takara反转录试剂盒进行RNA反转录：按照试剂盒操作要求在冰上配置纯化的Master Mix并按照步骤纯化m RNA（热循环仪：42℃，2 min→4℃）；根据后续需要应用的SYBR Green q-PCR要求进行反转录反应得到c DNA（热循环仪：37℃15 min→85℃，5 s→4℃）；（3）q-PCR检测Wnt非经典信号通路标志物Wnt5a、ROR2、FZD1和DKK1:Takara Prime Script RT-PCR试剂盒，每孔2μL样品c DNA底物加入0.8μL上游引物、0.8μL下游引物、10μL SYBR premix Ex Taq II，6.4μL的dH2O配成混合物在实时荧光定量PCR仪（Light Cycler 480 system）上进行两步法扩增反应。具体步骤如下：预变性（95℃，30 s，1 Cycle），PCR反应（95℃变性处理5 s，60℃退火20 s，40 Cycle），溶解曲线分析（90℃，0 s；65℃，15 s；95℃，0 s）。以GADPH为内参，记录扩增曲线Ct值，用2-??Ct法计算结果，每次设3复孔。引物序列见表1。