《表2 利用高通量测序平台批量获取DNA条形码的方法》

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《DNA条形码参考数据集构建和序列分析相关的新兴技术》

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科学家一直在尝试使用HTS平台以更低的成本和人工投入获取DNA条形码参考序列。为了解决读长的限制，不同的学者采用了不同的方法，包括:获取标准条形码序列的局部序列；用多轮PCR的方法扩增全长条形码的不同区域；又或者利用三代单分子高通量测序技术，如Pacific Biosciences的长读长单分子实时（Single Molecular Real Time，SMRT）测序系统；通过生物信息学算法来拼装填补由于读长限制而产生的序列中部的缺口（gap）。例如，早期的研究分别对不同物种单独进行PCR后再混合，通过Roche 454平台获取物种条形码序列（Shokralla et al，2014），但是由于测序通量的限制，化学试剂成本高，454平台被迫退出市场，而且此方法同Meier等（2016）的方法（基于Illumina平台）一样无法获取标准全长的条形码序列。研究人员还试图应用两轮PCR扩增，每一轮分别扩增全长条形码的部分序列随后通过简单拼接获取全长序列（Shokralla et al2015；Cruaud et al，2017）。另外，单分子测序平台SMRT技术可以获取环形一致序列（circular consensus sequences，CCSs），对一个分子多次测序可以有效校正该平台固有的高测序错误率（10%–16%）（Eid et al，2008） 。因此，有研究测试了将SMRT技术应用于条形码数据库构建的可行性（Liu et al，2017；Hebert et al，2018），研究测试的混合样品中，最复杂的样品有来自多达10，000个不同样本的DNA中的COI扩增子。结果表明随着其测序成本的进一步下降，SMRT技术将会是构建DNA条形码数据库方向的强有力的方法之一。Liu等（2017）还提出了一套新的解决方案（HIFI-Barcode），这是一套准确高效的生物信息学替代方案。该方法可以使研究者基于目前最经济高效的Hiseq平台，以现有成本的1/10获取全长条形码序列，而且不需要额外的PCR步骤（表2）。与此同时，该研究组还利用BGISEQ-500平台最新的单端400 bp（SE 400）测序技术开发了一套简单有效的DNA条形码数据库的实验和分析流程（HIFI-SE）（Yang et al，2018） 。此方法利用测序读长的优势，可以通过简单的两端序列比对连接从而获得全长的DNA条形码序列。