《表1 各种分子克隆方法的比较》

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《无限制克隆技术研究进展及其应用》

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DNA克隆技术是指将目的基因片段插入到特定的质粒中形成重组质粒，进而实现目的基因的扩增、转录或翻译的一种基本分子生物学实验技术，在生物医学领域研究中该技术有着非常重要的应用[1]．传统的分子克隆方法由于采用酶切连接的方式，会受到限制性内切酶酶切位点和DNA连接酶连接效率等条件的限制，导致克隆成功率较低且耗时长、耗费高[2-3]．为高效地克隆目的基因[4]，近年来各研究领域的科研工作者根据自身需要，发展出了多种基于重组的新克隆方法．这些方法各有千秋，亦有相应的不足（表1）．其中以通用载体质粒融合系统（UPS）[5]等为代表的位点特异性重组克隆技术，主要适用于大规模基因的高通量克隆、表达载体及文库构建[6-8]．该方法在细菌、酵母、哺乳动物等不同宿主的载体中均可应用，通过借助重组酶及其特异识别位点，实现高效、靶向性强的基因克隆．然而由于位点特异性重组酶和辅助因子等的使用，导致实验成本较高．此外，由于特异识别位点的限制，该方法无法实现多个DNA片段的无缝克隆，亦不适用于涉及高复杂性或多片段克隆的合成生物学研究．而以辅助交配遗传整合型克隆法（MAGIC）[9]等为代表的体内外同源重组克隆技术，则主要应用于文库的构建及多DNA片段组装[10-14]．该类方法既不需要使用位点特异性重组酶，也无需DNA的预处理，仅通过体内重组系统即可完成重组克隆．但MAGIC法需要准备供试菌株，基于细胞提取物的无缝连接克隆法（SLiCE）需要制备细胞提取物，基于PCR的IVA和OEPR克隆法可组装的片段长度和效率也会受到限制．再者，不依赖基因序列和连接反应克隆法（SLIC）[15-17]等基于单链退火拼接的克隆技术，主要应用于高通量克隆或多DNA片段组装的合成生物学研究[18-27]．这几类方法不受限制性酶切位点的限制，无需附加特定的重组位点，理论上均可实现无缝克隆．当然，其中一部分方法需要专利重组酶等，导致费用高昂，还有一部分方法需要对载体与目的基因进行预处理，产生单链同源突出末端，操作繁琐．更重要的是，其组装效率和正确率亦会随着DNA组装片段的增多而降低．