《表2 GGTA1和β4GalNT2基因型鉴定引物》

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《GGTA1/β4GalNT2双基因敲除近交系五指山小型猪的建立》

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退火温度62℃。

收集WZSP近交系35 d的胎猪，取皮肤剪碎后加入4～5 mL胶原酶消化液，消化30 min后，38℃培养。得到胎猪成纤维细胞后，将sgRNA表达载体GGTA1-sgRNA和β4GalNT2-sgRNA与SV-40-NeoR质粒共转染野生型WZSP胎儿成纤维细胞，将细胞以每视野下40～50个细胞（4倍视野）的浓度铺板，并用含有1 mg/mL G418和16%胎牛血清的DMEM培养液来进行抗药筛选去除阴性细胞，培养2～3 d后逐天降低G418的浓度，用0.3 mg/mL浓度维持培养，经过11 d左右的培养获得单细胞克隆。将克隆环放置在单细胞克隆的位置，用PBS洗1遍后，使用0.05%胰蛋白酶消化1～3 min，挑取到48或24孔板中继续培养，48孔板中的细胞长满皿底后传代至24孔板，24孔板长满后留取1/3细胞于原孔、2/3传代于12孔板，12孔板长满后，视细胞状态冻存，24孔板内的细胞消化下来，用NP40裂解提取基因组。经PCR扩增后进行第一步测序，引物序列见表2，将野生型、不会出现移码突变的基因组剔除后，选出GGTA1和β4GalNT2都是非野生型的基因组进行PCR产物纯化和TA克隆，每个细菌培养皿上挑取12～15个菌落测序。反应体系50μL，反应条件:95℃5min；95℃30 s，退火温度30 s，72℃30 s，35个循环；72℃7 min；保存4℃。