《表1 GGTA1和β4GalNT2基因sgRNA寡核苷酸序列》

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《GGTA1/β4GalNT2双基因敲除近交系五指山小型猪的建立》

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退火温度58℃。

根据NCBI数据库中猪GGTA1（Gene ID:396733）、β4GalNT4（Gene ID:2100621328）基因的序列，使用sgRNA在线设计软件（http://crispr.mit.edu/），根据Cas9靶点设计原则（5′端为G，3′端为PAM序列NGG）分别在第3个和第8个外显子设计合成靶向sgRNA，序列见表1，进行5′端磷酸化修饰，并在sgRNA两端加上能与BbsⅠ酶切位点相连接的黏性末端（由南京擎科生物公司合成）。经过引物退火、用BbsⅠ酶切回收p X330载体、线性化pX330与sgRNA连接后即构建好CRISPR/Cas9载体。将载体转化进入大肠杆菌后，涂布于细菌培养皿进行培养，得到并挑取单克隆菌落，扩增培养后提取质粒送测序。根据sgRNA设计引物（由南京擎科生物公司合成），对PCR产物测序，验证是否连接正确，反应体系20μL，反应条件:95℃5 min；95℃30 s，退火温度30 s，72℃30 s，35个循环；72℃7 min；4℃保存。