《表1 GGTA1/β4GalNT2基因组靶序列引物》

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《GGTA1/β4GalNT2双基因敲除的巴马小型猪PFFs细胞系的建立》

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单克隆的鉴定：将留下的1/5细胞从48孔板中消化下来，8000转离心3 min加入20～30μl NP40细胞裂解液，按照55℃1 h，95℃10 min的程序裂解得到单细胞克隆的基因组。再用得到的基因组进行PCR，PCR体系（2×Taq Master Mix，25μl；DNA，2μl；前引物，2μl；后引物，2μl；ddH2O，19μl），按照（GGTA1:95℃预变性，5 min；95℃变性，30 s；64℃退火，30 s；72℃延伸，30 s；β4GalNT2:95℃预变性，5 min；95℃变性，30 s；62℃退火，30 s；72℃延伸，30 s）的程序进行PCR（引物序列如表1）。浓度为1%的琼脂糖凝胶跑琼脂糖凝胶电泳，DL2000作为为标记物（Maker），胶回收试剂盒做切胶，得到胶回收产物，测浓度，然后与p MD18-T载体连接（体系：SolitionΙ，5μl；pMD18-T，1μl；目的片段，1.5μl；ddH2O，2.5μl），程序：16℃，70 min。将连接产物转化到感受态（DH5α）中，涂布到氨苄抗性的平板上，37℃恒温箱过夜，挑取单菌落送公司测序。与WT的序列比对得到敲除的基因型。