《表1 TALEN与CRISPR/Cas9在微藻研究中的研究实例》

  提示：宽带有限、当前游客访问压缩模式

本系列图表出处文件名：随高清版一同展现

《产油微藻基因组编辑技术研究进展》

1. 获取 高清版本忘记账户？点击这里登录

1. 下载图表忘记账户？点击这里登录

目前CRISPR/Cas9在微藻中的使用已经逐渐成熟。近期，Ajjawi等[34]优化了实验方法，使用电转化法将两个分别表达Cas9蛋白和外源插入基因的载体以及体外合成的sgRNA共转入微拟球藻（Nannochloropsis gaditana）细胞。使用这一流程分别成功敲除了N.gaditana的18个潜在的油脂合成负调控因子。通过代谢分析发现其中ZnCys突变体的碳向脂质的分配从20%上升到了40%～55%，并在进一步研究中获得了一种油脂产量两倍于野生型的工业藻株。从已有研究（如表1）可以看出，TALEN技术目前在微藻研究中应用较少，主要在硅藻P.tricornutum中获得成功，但其基因编辑的成功率相当高，突变子可达到克隆总数的50%。虽然TALEN技术需要设计表达特异性TALEN蛋白，相比CRISPR技术需要设计表达的sgRNA在实验设计上更有难度，更花时间，而且实验成本高，但其较高的成功率可大大减少载体转化、筛选突变的重复过程，也可显著缩短试验周期。由于CRISPR/Cas9技术的简易性，其在微藻研究中获得成功的尝试更多，如在C.reinhardtii、P.tricornutum、N.gaditana等多种微藻的研究中都成功实现了稳定的基因编辑。但以上研究中CRISPR/Cas9技术敲除基因的成功率也明显低于TALEN技术。在硅藻中应用CRISPR/Cas9技术还可能存在以下挑战:（1）出现SNP和indels（插入/删除）频率较高；（2）组成型表达的Cas9蛋白能够导致小的indel（1-2 bp）发生重编辑事件；（3）随着培养时间的延长整合进染色体的Cas9载体可能由于基因转换而发生丢失。尽管如此，CRISPR/Cas9技术最明显的优势在于编辑多个基因时，只需要改变针对目标基因改变人工设计的sgRNA即可，并且同时使用不同的sgRNA还可以实现多基因的同时敲除[35]。而TALEN技术需要针对不同基因分别设计表达上下游两个特异TALEN蛋白。所以，如果CRISPR/Cas9在微藻基因编辑研究的成功率得到提高，将更易于大量的基因编辑。