《表1 ScPP2C基因全长扩增所需引物序列》

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《割手密2C型蛋白磷酸酶ScPP2C基因的克隆与表达分析》

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首先，参照Tigen Trizol试剂盒说明书提取叶片总RNA，然后用逆转录试剂盒Fast Quant RT Super Mix（Tiangen，KR108）反转录获得c DNA第一链，具体操作先取稀释为50 ng总RNA 4μL、5×g DNA Buffer 2μL和ddH2O 4μL配制混合液，简短离心彻底混匀后置于42℃，孵育3 min，然后置于冰上放置。再加10×Fast RT Buffer 2μL、FQ-RT Primer Mix 2μL、RT Enzyme Mix 1μL和ddH2O 5μL配置成20μL的总体系，充分混匀后42℃，孵育30 min，95℃孵育3 min，将得到的cDNA可用于后续实验。参考本课题组所测得的转录组信息，用Primer 6.0和Oligo 7进行基因克隆的引物设计（表1）。以反转录获得的cDNA产物为模板，在ABI公司Veriti 96孔梯度仪上进行目的基因的扩增。20μL PCR反应体系为Template 1μL；Primer F 1μL；Primer R 1μL；Buffer2μL；dNTP 2μL；Pfu酶0.5μL；ddH2O 12.5μL，补足到20μL。PCR反应程序为首先94℃预变性3min；然后94℃变性30 s；54℃退火30 s；72℃延伸3 min；72℃，5 min，最后16℃保存。